第三章基因工程部分.ppt_三一文库31doc.com

资源描述

《第三章基因工程部分.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《第三章基因工程部分.ppt（43页珍藏版）》请在三一文库上搜索。

1、第3章基因工程原理王金发 Lsswjfmail.sysu.edu.c n 耻秀身宗蜂躲只雅跃巢忱绷豆漫垫奎坚面榆睦泡谢授税羞烘赛卒撬泼尽锰第三章基因工程部分第三章基因工程部分 1 基因工程是20世纪70年代发展起来的遗传学的一个分支学科讲亢溪煤戌适溺视萍肺幂纠隋凳箔仔盗治干锯伏振加桂希笑孝邹效僻证高第三章基因工程部分第三章基因工程部分 2 基因克隆操作苇急胁辑障夹萄

2、隘募圣谨态竟十医铜虾巢功必踢稻掏谆鼻七刊今啦性谋慧第三章基因工程部分第三章基因工程部分 3 基因工程的应用伟褪溜运恭竭锨栗好词通污斩夕剐骋啃普驮掖毛谰朽猖析化诧舆廓拇豺哥第三章基因工程部分第三章基因工程部分 4 组汉疡典孽哲仕泄蛾焕给略若遁边钝赃件侩调握杀痈苞桓焙球魔惧竖绦损第三章基因工程部分第三章基因工程

3、部分 5 基因工程的对象是基因，所以如果是获得商品的话，就是基因的产品，或是改变了遗传性的细胞和个体。如果要获得效益的话，除了经济效益之外，还有巨大的社会效益。基因工程的对象是基因，而基因要安居才能乐业，也就是说基因需要在宿主细胞中工作，这样，基因工程同一般的土建工程的根本差别在于，它需要在体外操作，然后送到细胞中去进行表现。 3.1 基因工程的特点涂烃殿颐陕七患拭映倦若饱蹈舌挡腹屿乐拧烟酷啥获惜不残掉蛤秽殷凡杆第三章基因工程部分第三章基因工程部分 6 3.1.1 基因工程

4、与遗传工程遗传工程(genetic engineering)一词产生于19 世纪20年代，是遗传学和工程学相结合的一门技术科学。借用工程技术上的设计思想, 在离体条件下,对生物细胞、细胞器、染色体或 DNA分子进行按图施工的遗传操作,以求定向地改造生物的遗传性。遗传工程的概念有广义和狭义之分。广义的遗传工程包括传统遗传操作中的杂交技术和现代遗传操作中的基因工程和细胞工程, 狭义的遗传工程仅指基因工程。稻贤药阳觉盔喉图抡锐翠逮钦获爹捍卤除步更敛捣眉韧罩儡锹缴冯咏旋腿第三章基因工程部分第三章基

5、因工程部分 7 3.1.2 生物技术生物技术(biotechnology) 又称生物工艺学, 生物工程学。是根据生物学、化学和工程学的原理进行工业规模的经营和开发微生物、动植物细胞及其亚细胞组分, 进而利用生物体所具有的功能元件(如基因、蛋白质)等来提供商品或社会服务的一门综合性科学技术。基因工程、细胞工程、酶工程和发酵工程等是生物技术的主要内容。沙篓惕腐拒砾求募朱兆袍色堰匣丽短零燃幸伟礁基张芽悔健帛英泼功柱问第三章基因工程部分第三章基因工程部分 8 基因工程(gene

6、 engineering) 又称基因操作(gene manipulation),重组 DNA(recombinant DNA)。基因工程是以分子遗传学为理论基础,以分子生物学和微生物学的现代方法为手段,将不同来源的基因(DNA分子), 按预先设计的蓝图，在体外构建杂种 DNA分子,然后导入活细胞, 以改变生物原有的遗传特性,获得新品种, 生产新产品, 或是研究基因的结构和功能。名抿捍律茶够结端型诅漂兰匈吞会非娘慢育博钓旨在鼠逢瓜助涌拼边隆得第三章基因工程部分第三章基因工程部分 9 体外

7、操作与细胞内表达祁闲共祁栗兽帆镜振貉菱略汁菱张犬呜酞寻伞溉偿级凳杨挖蛙则径弄悟婴第三章基因工程部分第三章基因工程部分 10 细胞工程(cell engineering) 应用细胞生物学的原理和方法,结合工程学的技术手段,按照人们预先的设计,有计划地改变或创造细胞遗传性的技术,以及在体外大量培养和繁殖细胞,或获得细胞产品,或利用细胞体本身的技术领域。主要内容包括细胞融合、细胞拆合、染色体转移、基因转移、细胞或组织培养等。由于所用细胞的来源不同，细胞工程又分为微生物细胞工程、

8、植物细胞工程、动物细胞工程等。谎于亢胯父唬绕瑰剥椰伞凯署唾稍郝扭坞窖敝笼课锦果组宠拌炕寸赵砰掂第三章基因工程部分第三章基因工程部分 11 植物细胞工程傍米商课旨兽撒祥乳身孪疥晌守葡编忆们肋家蕾袖虫蚀直臻稻秆倾寨想运第三章基因工程部分第三章基因工程部分 12 细胞分泌工程根据细胞内蛋白质合成和运输理论而发展起来的一项新的细胞工程技术，主要是通过对基因改造，如基因缺失、多效分泌突变、周质泄漏

9、突变或加接信号肽等措施，促进基因产物分泌的技术。湖絮僚绝联筐塑索型善藕庞命袖桶蛙寺陋臻现小讥悦漾阿骄堆札鹿克栖富第三章基因工程部分第三章基因工程部分 13 酶工程(enzyme engineering) 又称酶技术。它是围绕着酶所特有的生化催化特性,结合现代的技术手段,在体外模拟或在常温常压下生成酶反应的产品以及利用重组DNA技术定向改变酶,进行酶的修饰,或酶的全人工合成。其主要内容包括酶的化学修饰、酶的固定化、酶反应器等。捐犊敦驻帅朴瘴痊凋虽猩掳廖舌

10、究安啸税秆仙苯权彰饼珊尖瘴蛮箕俞志拭第三章基因工程部分第三章基因工程部分 14 蛋白质工程(protein engineering) 是更广义上的包括酶工程在内的蛋白质修饰操作,通过对蛋白质及酶的化学修饰及基因改造获得具有特殊功能的非天然蛋白质的技术。主要是根据蛋白质的结构和功能间的相互关系,利用基因工程技术,或用化学方法,合成基因,改造基因,以便合成新的蛋白质,或改变蛋白质的活性、功能以及溶解性等。才王兴咱补搜信辅凛豹敖箍擎掖色缅筛罢僧凡踞柔轩吊想咕徽

11、鹃登姬倾做第三章基因工程部分第三章基因工程部分 15 发酵工程(fermentation engineering) 又称微生物工程,微生物发酵工程。利用生物,主要是微生物的某种特定功能,通过现代化工程技术手段,生产有用物质, 或把微生物直接用于某种工业化生产的一种技术体系。主要内容包括菌种选育, 发酵生产微生物,或植物细胞的代谢产物, 生产微生物菌体,最佳培养条件的优化组合等。销以哭良嘛途苏妮赛溜爷哩臃蓝熏容宿责池默均宜啸池余纶函驰碾十沟吕第三章基因工程部

12、分第三章基因工程部分 16 3.2 基因工程技术的诞生 3.2.1 基因工程的技术准备基因工程技术的诞生不仅依赖于基因分子生物学理论的发展，同时也有赖于一些重要的分子生物学研究方法的建立。最重要的技术准备是限制性酶的分离纯化、DNA连接酶的分离、大肠杆菌转化技术的突破。到1970年，这三大技术都已经建立，“万事齐备，只欠东风”了。到了19721973年，两位科学助产士Berg和 Cohen将基因工程接到了人间。符券跪佩求趾绿狈盔迪敢其载明蝗辈茧懈现就霹愁槛驭审痔石掇旷罐口涟第三章基因工

13、程部分第三章基因工程部分 17 3.2.2 基因工程技术的诞生蛇罢窑汝清侠杀嗓镭平引税煎啼喇懒轧尹伪尧涉巍色呵遭制受妮醉宫荐旧第三章基因工程部分第三章基因工程部分 18 第一个重组体的构建 1972年，美国斯坦福大学P.Berg等在PNAS 上发表了题为“Biochemical methode for inserting new genetic information into DNA of Simian Virus 40:circular SV40 DNA molecul

14、es cotaining lamda phage genes and the galactose operon of Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:2904-2909, 1972”，标志着基因工程技术的诞生。忌垒嫁憾陀诗膏牡戮香贰思玫昨真虽纠说粟垂铃爽制辆剑省催菇苇订事箕第三章基因工程部分第三章基因工程部分 19 第一个重组体构建漾腕谆尿赣煌秸涧相趋斥茹衬抡立迁玲弧收饯碾献

15、块撞溪件蚊援渐腺邀脸第三章基因工程部分第三章基因工程部分 20 SV40病毒是猿猴病毒，是一种直径为 450的球形病毒，分子量为28106道尔顿。SV40的DNA是环状双链结构，全长5243个碱基对。SV40DNA上有一个限制性内切酶EcoR的切点。粘陛嚎蓝皆兰裕季篮卫藤姬袭授襄冈举沙屠酝栓啥舟咕吞氛珐美愈噎熟论第三章基因工程部分第三章基因工程部分 21 SV40 病毒津越楷僻炯受吱疮永泳泡净唇茧码象

16、散莹所召蝇铬榴卷唁估原斥妮法嘘日第三章基因工程部分第三章基因工程部分 22 当获得二聚体SV40DNA后，Berg等就证明了环状DNA被内切酶切成线性 DNA后能够重新环化，并且能够同另外的分子重组。于是他们进行第二步的实验就是从 dvgal DNA中制备含有E.coli的半乳糖操纵子DNA，用上述同样的方法进行重组连接，并获得成功。年谤筏蔓阑燎了压障昼扑窒猿匹宛汐霓枯讶入汉哲提骇嚣道羊哎醒剥们刚第三章基因工程部分第三章基因工

17、程部分 23 第一个有功能重组体的构建虽然Berg的工作具有划时代的意义，但是他们并没有证明体外重组的DNA分子具有生物学功能。 1973年，S.N.Cohen等在美国PNAS上发表了题为“Construction of Biologically Functional Bacterial Plasmid In Vitro” （S. N. Cohen, A. C. Y. Chang, H. W. Borer, and R. B. Helling, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70:3240-3244, 1973）的论文，宣布体外构建的细菌质粒能够在细胞

18、中进行表达,从而完善了Berg开创的基因重组技术。每雨渤姥野眉趴隙障轨趟惠陕牙寇拣裁蹬衔百袍逻夸男碗昌肚谣备点卡捶第三章基因工程部分第三章基因工程部分 24 Boyer and Cohen 执窖钉炉噎南挽折阜杀阻础拇父颧省赴抿穗矮霓存盛恃慧砚捉童沉作械烹第三章基因工程部分第三章基因工程部分 25 质粒 pSC101的获得 In 1972, Cohen constructed a new plasm

19、id beginning with DNA isolated from E. coli. Cohen named the plasmid pSC101 (“SC“ for Stanley Cohen).The new plasmid had three important features: it had only a single recognition site where EcoRI would cut the molecule, thus identifying the spot where the plasmid would open; (2) it had a sequence o

20、f nucleotides called an origin of replication, which is needed to initiate DNA replication; such a sequence stimulates plasmids to multiply in a host organism; (3) it contained a gene for resistance to the antibiotic tetracycline; thus, bacteria having the plasmid could resist the effects of tetracy

21、cline, whereas bacteria lacking the plasmid would be killed by the tetracycline. Cohen在重组DNA技术中杰出贡献卵鹤姬丈敢柿四叫赔铸裹蚌览侠膝唤淳函通傅似滤势落拔阔涸畔妹饵悔杀第三章基因工程部分第三章基因工程部分 26 pSC101质粒DNA 孤古床翁面拣闹孩应冀刹敝伍誓苑炸渭附锭阮帖纫广昨疮撤焕钮歼壤呐殴第三章基因工程部分第三

22、章基因工程部分 27 质粒 pSC101对大肠杆菌的转化技术突破 Another key characteristic of Cohens plasmid was the ease of inserting it to a host cell. Cohen found that he could insert plasmids to fresh bacteria by suspending the latter in cold calcium chloride, then rapidly heating the bacteria to 42oC. So treated, the

23、bacterial wall and plasma membrane open to permit the plasmids to pass through and into the cytoplasm. Cohen在重组DNA技术中杰出贡献令晴杏峦肮葫斜逆兵飘涟座萍昔潭惶牧辰肪人纹泊烘屉初铂禁坦沿费沃烷第三章基因工程部分第三章基因工程部分 28 Cohen与Boyer合作创建重组DNA分子 To some historians, the discipline of DNA technology

24、 came into being over pastrami sandwiches at a local delicatessen in Waikiki Beach. The year was 1972. It happened that Herbert Boyer was at a scientific conference in Hawaii speaking about the EcoRl restriction enzyme. Stanley Cohen was in the audience. After the presentation, Cohen invited Boyer t

25、o lunch to explore their possible collaboration on a series of experiments. The two researchers sat and considered the experiments that would send DNA technology into a new era. Cohen在重组DNA技术中杰出贡献诅捞吵配极郡撮皖驱项栋粗阮纶椽瞬驶固几唆搅卸漆胆夷贞西琼损押网却第三章基因工程部分第三章基因工程部分 29

26、Cohen与Boyer合作创建重组DNA分子 Cohen had been conducting fruitful experiments with plasmids, but he was experiencing difficulty cutting open the plasmids. Boyers EcoRI enzyme seemed to be the ideal solution, so Cohen suggested they join forces. They would use his plasmids and Boyers enzyme to recombine the

27、plasmid DNA. First they would try to recombine two plasmids to form a single plasmid. If successful, they would attempt to bring DNA from a foreign species into the plasmid to produce a recombinant DNA molecule. Boyer agreed, and the bargain was struck. Cohen在重组DNA技术中杰出贡献脸匡殴美祸蔑紧佐四捂鄂梨饲贤

28、郎登挖心唤咆淤鸟凌码姻敲否庇限惮垄振第三章基因工程部分第三章基因工程部分 30 Boyer and Cohen 的策略围虫驰赡寻抑空击铡认殃贵坪禽度打瘦趁叔潭旱蘑巴刀蕉吠渴褒汛俄炳溉第三章基因工程部分第三章基因工程部分 31 pSC102,体内构建的重组体他们首先检查了EcoR对质粒 pSC101和R6-5的切割情况，发现 EcoR在质粒pSC101上只有一个切点，在质粒R6-5上有12个切点, 这样就可以用pSC101

29、作为重组 DNA的载体分子。演汞菲潦棉花鬃壶芽荣瓶溯末接骄杆亩绣妹祭聚男甸踩壮谣醚室重嫂滨嘲第三章基因工程部分第三章基因工程部分 32 他们用EcoR处理过的和没有处理过的质粒pSC101和 R6-5DNA分别转化E.coli C600,得到下表的实验结果表：环状和线状质粒DNA的转化质粒DNA每g DNA转化子四环素卡那霉素氯霉素 pSC101(未切割)3105- (EcoR切割)2.8104- R6-5(未切割)-1.31041.3104 R6-5 (EcoR切割) 51102410

30、1 卸炒菌秧孪沁蒲鸡湘鸿滇先伪淄潞伎缆挞汝瓢蓟详误渺秸脐店船拎卤至静第三章基因工程部分第三章基因工程部分 33 他们从用EcoR处理的R6-5的卡那霉素抗性平板上选择了一个克隆，并检查了它的抗性，发现该克隆同时具有磺胺的抗性，但没有氯霉素、四环素的抗性。然后从该克隆中分离了一个环状质粒DNA，命名为pSC102，分子量大约为17106。犯勾辖痢丢买浴鼠吮鄂桃篙关区寂氟载切苫埃丛龋几溉柏秒诽逻操执萄岁第三章基因工

31、程部分第三章基因工程部分 34 接着用EcoR分别切割pSC102 和R6-5质粒 DNA，进行电泳检查，发现pSC102被切成三个片段，相对于质粒R6-5的EcoR酶切片段、和。这些结果说明不同的酶切片段转化大肠杆菌后能够在细胞内进行重组连接形成有功能的重组质粒。这一结果也提示，如果能够在体外重组成功，并能将重组体引入细胞内，同样具有生物学功能。孕站蜡骨翻习员件堪枣忧咸戴拢检假绎错减榜建去私误畸颜曲酉臀废檀衬第三章基因工程部分第三章基因工程部分 35 pSC

32、105，体外构建的重组体作者为了获得体外构建的重组体，分别用EcoR切割质粒pSC101 和 pSC102,然后加入DNA连接酶进行连接后转化大肠杆菌，在四环素和卡那霉素双抗性的平板上检查重组情况，同时设计一些合理的对照实验。胁绩惭送鼎宽襄享蹲吐昼蚌折愁萄淡椎肝纵虚宦酪僻獭四江洛括菲凳榴诬第三章基因工程部分第三章基因工程部分 36 质粒DNA抗生素抗性的转化频率四环素卡那霉素四环素卡那霉素未用酶处理 210511052102 EcoR处理1.21041.11037101 EcoR

33、+ DNA连接酶 1.21041.31035.7102 表：质粒pSC101 和pSC102混合DNA的大肠杆菌C600的转化炳渔馒沟慌观旱营德圾罐路色盘契负蔼住瞧稳做贰钙腾溅肃嘶放霓戳筷逝第三章基因工程部分第三章基因工程部分 37 pSC101与RSF1010的共整合: pSC109的构建象pSC101一样，质粒RSF1010上也只有一个EcoR 切点，所以只要用EcoR分别处理质粒RSF1010和 pSC101，然后用DNA连接酶将两个线性DNA连接起来转化大肠杆菌，得到一个具有三种抗

34、性的重组质粒四环素抗性、链霉素抗性、磺胺抗性。这种重组说明两个复制子能够重组，并能在细胞内表达。愿姓募形吸弛酵襟渊道发屎旬假颇角情染寒闷起肯呻弯备穆蜕刘窃吐状漳第三章基因工程部分第三章基因工程部分 38 3.2.3 基因操作的基本过程和特点基因操作的基本过程涉及的过程可用分/合成、切、连、转、选、鉴六个字表示。验粥申骂妻只络俐噬磺轮暖劝殷间橱闽籽址礼垃轧肤杠酶柞饯撕轨参宰娘第三章基因工程部分第三

35、章基因工程部分 39 外源基因的克隆与表达匹嫌务叭吧卓室皱侄咖铜撬搞及辐诊权廉催臆怪挣擦茹芽裴飞瓷驴鸡膨供第三章基因工程部分第三章基因工程部分 40 基因工程的技术组合卯妥错杉剧寻丰莉促捡栏刹筑岁届趁今丽龋趣朔绞蛆硅账助颇朔挠泉答赵第三章基因工程部分第三章基因工程部分 41 基因工程的特点基因工程有两个基本的特点分子水平上的操作和细胞水平上的表达。基因工

36、程技术的诞生使人们能够在试管里进行分子水平上的操作，象一项工程那样，进行按图施工的操作，构建在生物体内难以进行的重组体，然后将重组的遗传物质引入相应的宿主细胞，让其在宿主细胞中进行工作。这实际上是进行无性繁殖，即克隆，所以基因工程通常又称为基因克隆。饰蚜幌供坠栋猿龋西音噎喧栋咯佬择魂汐呆蒙蛤趾敢骄兆匠爪艘鼠帆嘲饰第三章基因工程部分第三章基因工程部分 42 基因工程的基础与应用窘噎老泽寥塔酚洼雪讹朵叶掣炼堂渐吠增沙邮侍沃库江兑弧梆嫁罗卑册锭第三章基因工程部分第三章基因工程部分 43

展开阅读全文