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1、附件3食品中罗丹明B的快速检测胶体金免疫层析法（KJ201703）1范围本方法规定了食品中罗丹明B的胶体金免疫层析快速检测方法。本方法适用于辣椒粉和辣椒酱中罗丹明B的快速测定。2原理本方法采用竞争抑制免疫层析原理。样品中罗丹明B经有机试剂提取，固相萃取小柱净化，浓缩复溶后，罗丹明B与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制了抗体和检测卡中检测线（T线）上抗原的结合，从而导致检测线颜色深浅的变化。通过检测线与控制线（C线）颜色深浅比较，对样品中罗丹明B进行定性判定。3试剂和材料除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的二级水。3.1试剂3.1.1正己烷。3.1.2丙酮。3.1.
2、3甲醇。3.1.4磷酸氢二钠。3.1.5磷酸二氢钠。3.1.6提取试剂：将正己烷与丙酮按照体积比80:20混匀。3.1.7复溶液：称取35.61g磷酸氢二钠(3.1.4)置于1000ml容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，制成0.2mol/L溶液A；称取31.21g磷酸二氢钠(3.1.5)置于1000ml容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，制成0.2mol/L溶液B。将溶液A与溶液B按照体积比67:33混匀，制成pH7.1磷酸盐缓冲液。3.2参考物质罗丹明B参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量见表1，纯度98.6%表1 罗丹明B参考物质中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式
3、、相对分子量中文名称英文名称CAS登录号分子式相对分子量罗丹明BRhodamineB81-88-9C28H31C1N2O3479.01注：或等同可溯源物质。3.3标准溶液配制3.3.1罗丹明B标准储备液（1mg/mL）：精密称取适量罗丹明B参考物质（3.2），置于10mL容量瓶中，用甲醇（3.1.3）溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为1mg/mL的罗丹明B标准储备液。冷藏，有效期6个月。3.3.2罗丹明B标准中间液A（1g/mL）：精密量取罗丹明B标准储备液（1mg/mL）（3.3.1）0.1mL，置于100mL容量瓶中，用甲醇（3.1.3）稀释至刻度，摇匀，制成1g/mL的罗丹明B标准中间液
4、A。临用新制。3.3.3罗丹明B标准中间液B（100ng/mL）：精密量取罗丹明B中间液A（1g/mL）（3.3.2）1mL，置于10mL容量瓶中，用甲醇（3.1.3）稀释至刻度，摇匀，制成100ng/mL的罗丹明B标准中间液B。临用新制。3.4材料3.4.1固相萃取小柱：中性氧化铝柱，1000mg/6ml。3.4.2免疫胶体金试剂盒（在28、干燥、避光条件下保存，在产品有效期内使用）。3.4.2.1金标微孔。3.4.2.2试纸条或检测卡。4仪器和设备4.1移液器：200L、1mL和10mL。4.2涡旋混合器。4.3离心机：转速4000r/min。4.4电子天平：感量为0.01g。4.5振荡器
5、。4.6样品浓缩仪：如有需要。4.7环境条件：温度：1525，相对湿度60%。5分析步骤5.1试样制备取具有代表性样品约500g，充分粉碎混匀，均分成两份，分别装入洁净容器作为试样和留样，密封，标记，于常温保存。5.2试样提取和净化准确称取试样2g（精确至0.01g）置于50mL具塞离心管中，依次加入20mL提取剂（3.1.6），振荡提取3min，以5000r/min离心5min。上清液待净化。吸取5mL提取剂（3.1.6）于固相萃取小柱（3.4.1）中，流出液弃去。将上清液全部转移至固相萃取小柱中，流出液弃去。再加入20mL提取剂（3.1.6）淋洗固相萃取小柱，流出液弃去。用5mL甲醇洗脱小
6、柱，收集洗脱液吹干。精密加入500L复溶液（3.1.7），涡旋混合1min，作为待测液。5.3测定步骤5.3.1试纸条与金标微孔测定步骤吸取200L样品待测液于金标微孔（3.4.2.1）中，抽吸510次使混合均匀，室温温育5min；温育结束后，将试纸条（3.4.2.2）吸水海绵端垂直向下插入金标微孔中，室温温育58min，从微孔中取出试纸条，去掉试纸条下端的吸水海绵，进行结果判定。5.3.2检测卡与金标微孔测定步骤吸取全部样品待测液于金标微孔（3.4.2.1）中，抽吸510次使混合均匀，室温温育5min；温育结束后，将金标微孔中溶液滴加到检测卡（3.4.2.2）上的加样孔中，室温温育58min
7、，进行结果判定。5.4质控试验每批样品应同时进行空白试验和加标质控试验。5.4.1空白试验称取空白试样，按照5.2和5.3步骤与样品同法操作。5.4.2加标质控试验准确称取空白样品2g或适量（精确至0.01g）置于50mL具塞离心管中，加入100L或适量罗丹明B标准中间液B（100ng/mL）（3.3.3），使罗丹明B浓度为5g/kg，按照5.2和5.3步骤与样品同法操作。6结果判定要求通过对比控制线和检测线的颜色深浅进行结果判定。由于长时间放置会引起检测线颜色的变化，需在规定时间内进行结果判定。目视结果判读依据如图1所示。6.1无效控制线（C线）不显色，表明不正确操作或试纸条/检测卡无效。6
8、.2阳性结果检测线（T线）不显色或检测线（T线）颜色比控制线（C线）颜色浅，表明样品中罗丹明B含量高于方法检测限，判定为阳性。6.3阴性结果检测线（T线）颜色比控制线（C线）颜色深或者检测线（T线）颜色与控制线（C线）颜色相当，表明样品中罗丹明B含量低于方法检测限，判定为阴性。6.4质控试验要求空白试验测定结果应为阴性，加标质控试验测定结果应为阳性。7结论当检测结果为阳性时，应对结果进行确证。8性能指标8.1检测限：罗丹明B为5g/kg。8.2灵敏度：灵敏度应99%。8.3特异性：特异性应85%。8.4假阴性率：假阴性率应1%。8.5假阳性率：假阳性率应15%。注：性能指标计算方法见附录A9其
9、他本方法所述试剂、试剂盒信息及操作步骤是为给方法使用者提供方便，在使用本方法时不做限定。方法使用者在使用替代试剂、试剂盒或操作步骤前，须对其进行考察，应满足本方法规定的各项性能指标。本方法参比标准为SN/T 2430-2010进出口食品中罗丹明B的检测方法(包括所有修改单)。附录A快速检测方法性能指标计算表表A.1 性能指标计算方法样品情况a检验结果b总数阳性阴性阳性N11N12N1.=N11+N12阴性N21N22N2.=N21+N22总数N.1=N11+N21N.2=N12+N22N=N1.+N2.或N.1+N.2显著性差异(2)2=(|N12-N21|-1)2/(N12+N21)自由度（
10、df）=1灵敏度（p+，%）p+=N11/N1.特异性（p-，%）p-=N22/N2.假阴性率（pf-，%）pf-=N12/N1.=100-灵敏度假阳性率（pf+，%）pf+=N21/N2.=100-特异性相对准确度，%c（N11+N22）/(N1.+N2.)注：a由参比方法检验得到的结果或者样品中实际的公议值结果；b由待确认方法检验得到的结果。灵敏度的计算使用确认后的结果。N：任何特定单元的结果数，第一个下标指行，第二个下标指列。例如：N11表示第一行，第一列，N1.表示所有的第一行，N.2表示所有的第二列；N12表示第一行，第二列。C为方法的检测结果相对准确性的结果，与一致性分析和浓度检测趋势情况综合评价。本方法负责起草单位：山西省食品药品检验所。验证单位：陕西省食品药品监督检验研究院、四川省食品药品检验检测院。主要起草人：杨国伟、张烨、王媛媛、李倩。