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1、CRISPR/CAS9慢病毒系统 吉凯基因 CRISPR/CAS9系统原理系统原理 CRISPR/CAS9系统: 基因组定点切割系统。 定点:sgRNA,碱基互补配对 切割:CAS9蛋白,核酸内切酶 无模板 随机修复(NHEJ) 读码框移位 蛋白无表达 Knock out 有模板 重组修复(HDR) 精确插入碱基 Knock in CRISPR/CAS9系统原理系统原理 Gene knock out Gene knock in CRISPR/CAS9 VSRNAi-敲除效果敲除效果 lentiCRISPRs abolished EGFP fluorescence in 938% of cell
2、s after 11 days. 参考文献:参考文献:Science. 2014 Jan 3;343(6166):84-7. doi: 10.1126/science.1247005 Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. CRISPR/CAS9 VSRNAi-靶点一致靶点一致 参考文献:参考文献:Science. 2014 Jan 3;343(6166):84-7. doi: 10.1126/science.1247005 Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening i
3、n human cells. 靶点间一致的概率: CRISPR/CAS9:7827% shRNA:2012% CRISPR/CAS9 VSRNAi-表型呈现表型呈现 RNAi 敲减敲减OK 无表型无表型CRISPR/CAS9 表型明显表型明显 参考文献:参考文献:Science. 2014 Jan 3;343(6166):84-7. doi: 10.1126/science.1247005 Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. CRISPR/CAS9 VSRNAi 对比RNAiCAS9 作用水平mRNA水平基因组
4、水平 靶位点范围仅转录本 所有基因组序列,如外显子,内含 子,启动子,增强子,基因间序列等 靶蛋白消除水平不完全消除完全消除 靶蛋白功能部分丧失完全丧失 消除后具功能靶基因表型呈现不一定呈现肯定呈现 针对同一基因多靶点表型一致率2012%7827% 参考文献:参考文献:Science. 2014 Jan 3;343(6166):84-7. doi: 10.1126/science.1247005 Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. 与RNAi相比,CRISPR/CAS9在基因功能学研究中具有独到优势: CRIS
5、PR/CAS9系统系统载体载体 质粒质粒慢病毒慢病毒腺病毒腺病毒 构建时间构建时间7 days,快25 days,较快较快45 days,慢 使用范围使用范围少数易转细胞,窄大多数细胞,宽宽大多数细胞,宽宽 导入效率导入效率少数较高多数高多数高多数高多数高 细胞分裂表达水平细胞分裂表达水平减弱,直至丢失稳定表达稳定表达减弱,直至丢失 对细胞状态影响对细胞状态影响较大小小较大 持续表达时间持续表达时间短长,可永久表达长,可永久表达较长,终会丢失 功能学研究适用度功能学研究适用度局限适用适用细胞状态影响大 慢病毒载体在基因功能学研究中具有独到优势: 新高大上:新高大上:CRISPR/CAS9与慢病
6、毒与慢病毒 Paper 1:High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells. IF:42Journal: Naturedate:2014 May Paper 2: Genome-wide recessive genetic screening in mammalian cells with a lentiviral CRISPR-guide RNA library. IF:39.08Journal:Nat Biotechnoldate:2014 Mar Paper
7、 3: Generation of mouse models of myeloid malignancy with combinatorial genetic lesions using CRISPR-Cas9genome editing. IF:39.08Journal: Nat Biotechnoldate:2014 Jun Paper 4: Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. IF:26Journal: Nat Methodsdate:2014 Jul 方式一:方式一:双双慢病毒载体介导的慢病毒
8、载体介导的CRISPR/CAS9 Paper 1:High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells. IF:42Journal: Naturedate:2014 May CAS9稳定表达细胞株CAS9表达慢病毒 sgRNA表达慢病毒 EGFP绿色荧光筛选 细胞出现表型 感染稳定细胞株 基因功能确定 吉凯吉凯CAS9双载体慢病毒系统介绍双载体慢病毒系统介绍 切割: Lenti-CAS9-puro 表达CAS9蛋白+puromycin筛选 定位:Lenti-sgRNA-
9、EGFP/RFP/G418 表达sgRNA+EGFP荧光标记 吉凯吉凯CAS9双载体慢病毒系统介绍双载体慢病毒系统介绍 切割: Lenti-CAS9-puro 滴度可达2E+8 已成功构建两株CAS9稳定表达细胞株 定位:Lenti-sgRNA-EGFP 滴度可达3E+8以上 可成功引入突变 ctl nc C1 C2 Cas9 nc G1 nc G2nc G3 吉凯吉凯CAS9双载体慢病毒系统介绍双载体慢病毒系统介绍 -wt 缺失 23bp 增加 10bp CAS9双载体慢病毒系统可成功对靶位点造成修饰 缺失 37bp 增加 1bp -wt 例1: 例2: 吉凯吉凯CAS9双载体慢病毒系统介绍
10、双载体慢病毒系统介绍 吉凯所设计sgRNA具有高阳性率。 吉凯吉凯CAS9双载体慢病毒系统介绍双载体慢病毒系统介绍 吉凯所设计sgRNA具有高阳性率。 方式二:方式二:单单慢病毒慢病毒载体介导的载体介导的CRISPR/CAS9 Paper 5: Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. IF:31Journal: Sciencedate:2014 Jan 感染一个病毒,同时表达CAS9蛋白和sgRNA 吉凯吉凯CRISPR/CAS9单载体单载体慢病毒系统介绍慢病毒系统介绍 定位:定位: sgRNA 切割:切割:CAS
11、9 标记:标记:Puromycine/EGFP 吉凯吉凯CRISPR/CAS9单载体单载体慢病毒系统介绍慢病毒系统介绍 CAS9 蛋白表达 可对靶位点有效切割 可成功引入突变 ctl nc C1 1 2 nc Cas9 CRISPR/CAS9慢病毒系统应用 Gene功能研究: 针对敲减无功能基因 感染后细胞进行相关功能研究,并多靶点验证 CRISPR/CAS9 HCS高内涵筛选系统 文库:(敬请期待) Human sgRNA Library Mouse sgRNA Library 与深度测序联用,功能相关靶基因筛选 境况境况1:基因:基因RNAi后后无表型无表型? 换用换用CRISPR/CAS
12、9慢病毒试试慢病毒试试! Science. 2014 Jan 3;343(6166):84-7. RNAi 敲减敲减OK 无表型无表型CRISPR/CAS9 表型明显表型明显 境况境况2:基因组突变疾病相关研究?:基因组突变疾病相关研究? RNAi间接甚至不可用!慢病毒间接甚至不可用!慢病毒介导介导的的CRISP/CAS9技术!技术! Paper 1: MLL3 is haploinsufficient 7q tumor suppressor in acute myeloid leukemia. IF:24Journal: cancer celldate:2014 May MDS(骨髓发育不良
13、症候群)和(骨髓发育不良症候群)和AML(急性髓细胞样白血病)常见(急性髓细胞样白血病)常见染色体染色体7q部分部分 缺失。缺失。通过通过CRISPR/CAS9技术验证其上技术验证其上MLL3基因是发挥作用基因。基因是发挥作用基因。 Paper 2: Generation of mouse models of myeloid malignancy with combinatorial genetic lesions using CRISPR-Cas9 genome editing. IF:39.08Journal: Nat Biotechnoldate:2014 Jun 恶性肿瘤往往存在恶性肿
14、瘤往往存在多处基因组突变。多处基因组突变。通过慢病毒介导的通过慢病毒介导的CRISPR/CAS9技术对小鼠技术对小鼠 hematopoietic stem cell (HSC)5个基因进行修饰,导致恶性肿瘤个基因进行修饰,导致恶性肿瘤AML。 境况境况3:RNAi有有功能!功能! CRISPR/CAS9锦上添花!锦上添花! Cancer Cell. 2014 May 12;25(5):652-65. doi: 10.1016/j.ccr.2014.03.016. Epub 2014 May 1. MLL3 is a haploinsufficient 7q tumor suppressor in acute myeloid leukemia RNAi证明:证明: CRISPR/CAS9验证:验证: 境况境况4:老老树开新花!树开新花! CRISPR/CAS9老基因研究!老基因研究! J Orthop Res. 2014 Oct 27. doi: 10.1002/jor.22745. Targeting Cdk11 in osteosarcoma cells using the CRISPR-cas9 system. 增殖 转移 侵袭 检测原理检测原理