以离子液体为介质生物胺的液相色谱测定.pdf

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1、安徽农业科学。J o u r n a lo fA n h u iA 翊S e i 2 0 1 1 ，3 9 ( 2 1 ) ：1 3 0 8 5 1 3 0 8 7责任编辑郑丹丹责任校对卢瑶 以离子液体为介质生物胺的液相色谱测定 玉澜，卢翠文，谢济运8( 柳州师范高等专科学校，广西柳州5 4 5 0 0 4 ) 摘要 目的 寻求一种快速、简单、易推广的检测方法采测定食品和饮料中生物胺的含量。 方法 以丹磺酰氯为衍生剂，室温离子液 体作为萃取、富集、衍生介质来测定食品和饮料中生物胺的舍量。 结果 测定的过程包括柱前工作和色谱分离两部分，得出比较理想的 衍生条件：丹磺酰氯溶液1 5r n l ，p

2、 H9 1 0 缓冲液2 0m l ，室温离子液体1 0m l ，置于超声清洗器中超声3 0m i n ；超声后提取离子液注入 H P L C ，用U V 检测仪( A = 2 5 4 1 6n m ) 可以使6 种生物胺在3 0m i n 内被分离出来。该方法将衍生、萃取和富集3 个步骤集于一体。大大地 简化了试验，离子液体可以有效地促进分离，稳定性良好，且所建立的方法线性范围良好。 结论 测定食品和饮料中生物胺的含量，以 丹磺酰氯为衍生剂，室温离子液体作为萃取、富集、衍生介质是一种快速、简单、易推广的检测方法。 关键词室温离子液；生物胺：高效液相色谱 中图分类号$ 3 7文献标识码A文章编

3、号0 5 1 7 6 6 l l ( 2 0 1 1 ) 2 l 一1 3 0 8 5 0 3 D e t e r m i n a t i o no ft h eB i o g e n i cA m i n e si nt h eM e d i ao fI o n i cS o l u t i o nw i t ht h eM e t h o do fL i q u i dC h r o n m t o g r a p h y Y UL a ne ta l ( D e p a r t m e n to fC h e m i s t r ya n dL i f eS c i e n c e ，“

4、u z h o uT e a c h e r sC o l l e g e ，L i u z h o u ，G u a n g x i5 4 5 0 0 4 ) A b s t r a c t O b j e c t i v eJ1 h et e s t i n gm e t h o do ft h eb i o g e n i ca m i n e s ( B A s ) i nf o o da n db e v e r a g ew a sd e v e l o p e d M e t h o d n ec o n t e n to fB A si n t I ef o o da n db

5、 e v e r a g ew a st e s t e dw i t ht h ed a n s l yc I l o r i d ea sd e r i v a t i z a t i o na g e n ta n dt h er o o mt e m p e r a t u r ei o n i cl i q u i d ( R I I T ) a st h em e d i u mo f e x t r a c t i o n ，e n r i c h m e n ta n dd e r i v a t i z a t i o n R e s u l t n et e s t i n

6、 gp r o c e s si n c l u d e dt h ew o r ko fp r e c o l u n l na n dc h r o m a t o g r a p h i cs e p a r a t i o na n dt h ei - d e a lC O I l d i t i o no fd e r i v a t i v eW E I S f o l l o w s ：t h ed a m y lc h l o r i d es o l u t i o n ，1 5m l ；t h eb u f f e r ( p H9 1 0 ) ，2 0n da n dt

7、h eR I L T 。1 OI I l l 。w h i c hW a S p l a c e di nu h r a s o n i cc l e a n e rf o r3 0m i n u t e s t r e a t m e n to fu l t r a s o u n d 鸭ee x t r a c t e dR I L Ta f t e ru l t r a s o n i ct r e a t m e n tw 幽i n j e c t e di n t ot h eH P L c a n ds i xt y p e so fB A sw e r es e p a r a

8、t e dw i t h i n3 0m i n u t e sw i t hU Vd e t e c t o r ( A = 2 5 4 1 6 珊) n r e ep r o c e d u r e s ：d e r i v a t i z a t i o n e x t r a c t i o na n de n r i c h m e n tw e r ec o m b i n e di nt h et e s t i n gm e t h o d w h i c hw a sg r e a t l ys i m p l e 1 1 1 ei o n i cs o l u t i o

9、nc o u l de f f e c t i v e l yp r o m o t et h es e p a r a t i o nw i t hg o o ds t a b i l i t y a n dt h em e t h o dw a sa l s ow i t hg o o dl i n e rr a n g e C o n c l u s i o n T h i sm e t h o dW a sq u i c k 。s i m p l i c i t ya n de a s yt ob eo p e r a t e d K e yw o r d s R o o mt e m

10、 p e r a t u r ei o n i cl i q u i d ；B i o g e n i ca m i n e s ；H P L C二 生物胺是具有生物活性的低分子量有机含氮化合物，在 鱼、肉、奶酪、发酵制品、新鲜水果和蔬菜中都有存在。有 研究表明，动物试验和临床研究都发现肿瘤生长程度与局部 组织、体液内多胺浓度( 腐胺、尸胺、精胺、亚精胺) 正相关，认 为测定组织和体液中多胺浓度可作为诊断、监视肿瘤及评价 治疗效果的有效手段悼1 。所以对生物胺的检测是非常有必 要的，目前常用的方法是高效液相色谱法旧“o 。 但由于生物胺在食品中的含量低，多数的产物需要浓 缩，即要经过萃取、富集

11、和衍生这个过程，这个过程的成功与 否对生物胺的检测结果影响甚大。目前最常用的生物胺衍 生试剂是丹磺酰氯( D n s C l ) 和邻苯二甲醛( O P A ) “1 。常用 的革取方法主要有同相萃取( S P E ) 法和液一液萃取( u J E ) 法。7 1 。但S P E 法操作复杂，使用很不方便，普及难度很大； L L E 法大量使用有机溶剂萃取，易造成二次污染。因此，寻找 无毒、低挥发性的高效富集、萃取和衍生介质是十分重要的。 离子液体具有一系列突出的优点旧10 | ，如蒸汽压近似等 于零，不挥发，毒性小，具有较大的稳定温度范围、较好的化 学稳定性及较宽的电化学稳定电位窗。笔者提出

12、以室温离 子液“2 11 己基- 3 甲基咪唑六氟磷酸盐( 【H M I M P F 6 ，1 h e x y l - 3 一m e t h y li m i d a z o l i u mh e x a f l u o r o p h o s p h a t e ) 作为萃取、富 集和衍生介质，丹磺酰氯衍生生物胺，衍生后生物胺进入离 子液层，并提取离子液层用H P L C 对其进行分析。 1 材料与方法 1 1 仪器与试剂 A g i l e n t1 1 0 0s e r i e s 高效液相色谱仪 美 国安捷伦仪器公司，D A D 检测器，D i a m o nS i l ( 钻石) -

13、 C ，。色谱 作者简介 收稿日期 玉澜( 1 9 7 6 一) ，男，广西柳州人，讲师，从事食品检测方 法的研究，E - m a i l ：y u t a n l 9 7 6 1 2 6 c o m 。 通讯作者， 高级实验师。从事化学工艺与林产化工研究，E - m a i l ： l z s z x j y 12 6 c o r n 。 2 0 1 1 0 4 1 9 柱，5I t m ，2 5 0 0m mx 4 6m i l l ；L 4 型恒温加热磁力搅拌器 ( 河南省巩义市站街光亚仪器厂) ；S H B H I 型循环水式多用真 空泵( 河南省巩义市站街光亚仪器厂) ；R 一2 0

14、 1 旋转蒸发仪 ( 上海申胜生物技术有限公司) ；Z X Z 1 旋片真空泵( 上海申 胜生物技术有限公司) ；W 2 0 1 B 恒温水浴锅( 上海申胜生物 技术有限公司) ；H S 3 1 2 0 T 超声清洗器( H e n g a oT & D ) ；机械 搅拌装置。1 溴己烷、乙酸乙酯、乙醚、丙酮、四硼酸钠均为 分析纯；N 甲基咪唑、K P F 。为工业级；乙腈及丹磺酰氯为色 谱纯；精胺( S p d ) 、腐胺( P u t ) 、尸胺( C a d ) 、酪胺( ，I 扣) 、苯乙胺 ( P h e ) 、色胺( 研) 均为A C R O S 公司生产，含量为9 7 一 9 9

15、 。 1 2 方法 1 2 1 H M I M P R 离子液的合成。离子液的合成方法为 两步合成法：第一步季铵盐反应，制备出目标阳离子卤盐；第 二步离子交换，用目标阴离子Y 一置换出x 一来得到目标 产物。 1 2 1 1 季铵盐反应。反应式为M I M + C 。H 】3B r 一 H M I M B r 。取N 甲基咪唑8 2 2g ( O 1m 0 1 ) 置于三口烧瓶 中，用加热套进行加热，并用磁力搅拌器搅拌，当温度达到7 5 时，开始缓慢滴加1 一溴己烷( 1 一溴己烷：N 一甲基咪唑= 1 1 ：1 0 ，物质的量比) ，滴加完成后，温度控制在8 5 继续搅 拌反应2h ，反应完

16、全后得到金黄色、透明、稠状的液体。冷却 至5 0 左右，用乙酸乙酯萃取过量的反应原料( 萃取5 次，每 次3 0I l l l ) ，最后减压蒸馏除去残留的乙酸乙酯，得 H M I M B r 。 1 2 1 2 离子交换反应。反应式为 H M I M B r + K P F 6 一 H M I M P F 。季铵盐 H M I M B r 用加热套加热，并改用机械 搅拌，加入1 0 0m l 蒸馏水和2 0 3gK P F 6 ，保持温度在7 0 左右，搅拌约4h ，反应完毕后静置一段时间，使离子液层和 水层完全分开，倾去水层，然后用预热的蒸馏水1 0 0m l ( 4 0 万方数据 1 3

17、 0 8 6 安徽农业科学 2 0 1 1 年 5 0 ) 清洗离子液5 次，得离子液体 H M I M P R 粗产品，再 在粗产品中加入2 0 “乙醚萃取，取下层液体转移到旋转蒸 发仪进行减压蒸馏，除去杂质和多余的水和乙醚，最后得到 浅黄色、透明、稠状液体 H M I M P R 。j 1 2 2 生物胺的衍生和测定。生物胺本身既没有荧光特性 也没有特异的紫外吸收基团，但在一定条件下生物胺可以同 丹磺酰氯反应生成具有荧光或紫外吸收特性的衍生物，进而 应用R P - H P L C 进行定量分析。 1 2 3 溶液的制备。 1 2 3 1 缓冲液的配制。准备5 个干燥洁挣的2 5 0n d

18、容量 瓶，分别称取5 份0 9 5 1g 四硼酸钠置于5 个容量瓶中，用超 纯水溶解并用N a O H 调节p H 至8 1 0 、9 1 0 、1 0 1 0 、1 1 1 0 、 1 2 1 0 ，然后用去离子水定容至刻度，摇匀。 1 2 3 2 丹磺酰氯溶液的配制。准备1 个干燥洁净的2 5 0 d 容量瓶，精确量取0 3 3 8g 丹磺酰氯于容量瓶中，用丙酮 稀释并定容至刻度。摇匀，低温保存备用。得到的衍生剂丹 磺酰氯的浓度为5r a m o l L 。 1 2 3 3 单标的配制。准备6 个干燥洁净的1 0 0m l 容量 瓶，分别精确称取苯乙胺、酪胺、腐胺、尸胺、精胺、色胺各0 1

19、 g ，分别置于1 0 0m l 容量瓶中，用去离子水稀释并定容至刻 度，振荡使其溶解，低温保存备用。得到的单标浓度均为 1m g T d 。 1 2 3 4 混标的配制。准备1 个干燥洁净的1 0 0m l 容量 瓶，精确移取苯乙胺、酪胺、腐胺、尸胺、精胺、色胺单标各2 “于1 0 0m l 容量瓶中，用去离子水稀释并定容至刻度，摇 匀，低温保存备用。所配混标中的各组分浓度为2 0 g a 。 1 2 4 液相色谱条件。色谱柱：D i a m o nS i l ( 钻石) 一C 。( 5 ，2 5 0 0m mx 4 6m m ) ；D A D 检测器；测定波长：2 5 4 1 6 r a

20、m ；柱温3 0 ；流速：1m l m i n ；进样量：1 0 山；流动相梯度见 表1 。 裹I 流动相梯度 T a b l elG r a d i e a to fm o v i ep h a s e 时间流动相M o b i l ep h a s e 啊l l l e m i n 水W a t e r乙腈A c e I o m t r i l e 04 5 5 5 1 0 3 07 0 1 52 0 8 0 2 00 1 0 0 3 04 55 5 2 结果与分析 2 1 峰型识别 2 1 1 H M M P F 6 离子液的峰型识别。只进样离子液，按 “1 2 4 ”液相色谱条件得8

21、P L C 色谱( 图1 ) 。 2 1 2 衍生剂丹磺酰氯溶液的峰型识别。只进样丹磺酰氯 溶液，按“1 2 4 ”液相色谱条件得H P L C 色谱( 图2 ) 。 2 1 3 各种胺的峰型识别。取7 支干燥洁净的具塞试管， 分别加入苯乙胺、色胺、腐胺、尸胺、酪胺、精胺及混胺各2 盯d ，缓冲溶液( p H 9 1 0 ) 20m l ，丹磺酰氯溶液1 5m l ，离子液 1 0m l ，置于超声清洗器超声3 0m i n ，期间取出用手振荡，使 生物胺充分被萃取。反应结束后，静置片刻，待分层以后，取 下层离子液进样分析。 时间T i m m i n 图1 佃删 P F 。离子液的峰型 n

22、g 1p e a kp a t t e r no f 1 l b l I M P F i o n i cl i q u i d 1 051 01 52 02 5 时间T i m 岫i n 图2 丹磺酰氯溶液的峰型 F i g 2 P e a kp a t t e r no fd a n s y lc h l o r i d es o l u t i o n 时间T i n ：m 【n 图3 各种胺的峰型 F j 昏3P e a kp a t t e r no fe a c hl i n do fa m i n e ； i 生物胺B i o g e n i cm i n e 图4 不同p H 缓

23、冲液对各种胺衍生化反应的影响 F i g 4 F f f e ao td i f f e n n tp Hb u f f e rs o l u U o no i lM o c h e m i c a lr c - f i o nO fe a c hk i n do fa l - 1 i 腿 由图3 可见，将6 个单标与混标作比较根据各单峰出 峰时间得出混胺中各组分的流出顺序。按时l - 日J 先后混标中 枷瑚啪湖枷栅瑚。 万方数据 3 9 卷2 l 期 玉澜等以离子液体为介质生物胺的液相色谱测定 的6 个峰分别为色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、酪胺、精胺。 2 2 不同p H 缓冲液对反应的影响取5

24、 支干燥洁净的具 塞试管，分别加入混胺2 0m l ，丹磺酰氯溶液1 5m l ，离子液 1 0I T l l ，缓冲液( p H8 1 0 、9 1 0 、1 0 t o 、1 1 1 0 、1 2 1 0 ) 各2 0 I I l l ，置于超声清洗器超声3 0m i n ，期间取出用手振荡，使生物 胺充分被萃取。反应结束后，静置片刻，待分层以后，取下层 离子液进样分析。由图4 可见，混胺衍生化反应最佳缓冲液 p H 为9 1 0 。 2 3 离子液体萃取的能力取2 支具塞试管，编号l 、2 。分 别加入混胺2 0m l ，丹磺酰氯溶液1 5l I l l ，缓冲液( p H9 1 0 )

25、 2 0m l ，然后向1 号试管中加入1 0l I l l 离子液，2 号试管不加 离子液。置于超声清洗器超声3 0m i n ，期间取出用手振荡， 使生物胺充分被萃取。反应结束后，静置片刻，待分层以后， 取下层液体1 0 一进样量，测得峰高( m a U ) 见表2 。 表2 离子液体对各种胺萃取的影响 T a b l e2E f f e c to fi o n i cl i q u i do nt h ee x t r a c t i o no fe a c hH n do fa m i I 埒 m A U 由表2 可以看出，离子液对生物胺的萃取、富集、衍生具 有明显的促进作用。 2 4

26、 线性范围重新配制浓度为0 1 、0 5 、1 O 、1 5 、2 0 、 2 5 、3 0o e C m l 混胺溶液各1 0 0n d ，各浓度分别取2m l = c J U A 7 支干燥洁净的具塞试管，并加入缓冲溶液2 0m l ，丹磺酰氯 溶液1 5r n l ，离子液1 0m l ，置于超声清洗器超声3 0m i n ，期 间取出用手振荡，使生物胺充分被萃取。反应结束后，静置 片刻，待分层以后，取下层离子液进样分析。进样分析后，测 得各生物胺在不同浓度时的峰高( m A U ) ( 表3 ) 。以色谱峰峰 高( m A U ) 对混胺浓度回归，可得回归方程及线性范围( 表4 ) 。

27、 表3 不同浓度生物胺的衍生结果 T a b l e3D e r i v a t i v er e s u l t so fd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so fb i o g e n i c8 m i l 地 m A U 浓度色胺 苯乙胺腐胺尸胺 酪胺精胺 C o n c e n t r a t i o n p , g m l T r y p t a m in e P h e n y l e t h y l a m i n e ，P u t r e s c ，i ，n e C a d a v ，e r i n e T y ra m i

28、n e 表4 各种胺的线性方程及线性范围 T a b l e 4L i n e a re q u a t i o n sa n dl i n e a rr a n g eo fe a c hk i n do fa m i n e 待测组分线性范围线性方程 D e t e c t e d t o b eL i n e a rL i i l e a r c o m p o n e n t sr a n g e 斗m le q u a t i o n s 相关系数( R 2 ) R e l a t e d c 【，e f f i c i e n t s 色胺T r y p t a m i n e 0

29、 5 3 0 Y = 1 7 6 1 x + 8 0 1 8 0 9 5 7 苯乙胺0 1 3 0 Y = 3 3 2 8 x 1 6 3 7 o - 9 9 0 P h e n y l e t h y l a m i n e 腐胺P u t r e s e i n e 0 5 3 0 y = 7 1 7 5 x + 9 3 8 9 0 9 8 3 尸胺C a d a v e r i n e0 5 3 0 y = 7 3 7 8 x + 8 8 7 2 0 9 8 l 酪胺T y r a m i n e 0 1 2 0 Y = 4 6 1 l z 一2 3 7 2 0 9 8 7 精胺S p

30、e r m i n e 0 5 2 5 Y = 2 3 2 7 x 一4 6 7 9 0 9 5 8 3 小结 用室温离子液体 H M I M P F 6 为介质，衍生、萃取和富集 食品中的生物胺，不仅将衍生、萃取和富集3 个步骤集于一 体，大大地简化了试验，而且离子液体可以有效地促进分离， 稳定性良好。所建立的方法线性范围良好。试验还对体系的 一些参数进行优化，得出比较理想的衍生条件：加人生物胺单 标或者混标溶液2 0 m l ，丹磺酰氯溶液1 5 I I l l ，p H 9 1 0 缓冲液 2 0I I l l ，离子液体1 0m l ，置于超声清洗器中超声3 0m i n 。 参考文献

31、 1 冯雅蓉，马 郦参生物胺对食品安全和人类健康的重要性 J 肉类研 究，2 0 0 5 ( 1 2 ) ：2 5 2 8 2 董f 韦峰，林维宣，田苗，等固相萃取一高效液相色谱法测定七种痕量 生物胺 J 食品研究与开发，2 0 0 6 ，2 7 ( 1 ) ：1 0 7 1 1 1 3 李志军，薛长湖，吴永宁反相高效液相色谱法测定食品中生物胺 J 食品T 业科技。2 0 0 5 ，2 6 ( 4 ) ：1 7 5 1 7 8 4 陆永梅，董明盛，吕欣等高效液相色谱法测定黄酒中生物胺的含量 J 食品科学，2 0 0 6 ，2 7 ( 1 ) ：1 9 6 1 9 9 5 丁琪，乐长高室温离子液

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