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1、 收稿日期: 2007 - 12 - 28;修回日期: 2008 - 03 - 03 基金项目:北京市自然科学基金资助项目(7072042) 作者简介:邢国振(1980 ) , 男,硕士研究生,研究方向为药 物毒理学。 3:通讯作者,教授,主要研究方向为毒理学。Tel:010 82801527, E2mail:bxzhangbjmu1edu1cn。 大蒜素对二甲基甲酰胺致小鼠急性肝损伤的预防作用 邢国振,贾凤兰,阮明,张宝旭 3 (北京大学公共卫生学院毒理系,北京 100083) 摘要:目的 研究大蒜素对二甲基甲酰胺(N,N2dimethylformamide, DMF)致小鼠急性肝损伤的预防
2、作用。方 法 采用DMF致小鼠急性肝损伤模型,染毒48 h后,测定血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶 (AST)和乳酸脱氢酶(LDH)的活性;留取肝脏组织,常规石蜡包埋切片, HE染色,光镜观察肝脏组织病理变化; 制备肝匀浆,测定肝中还原型谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)和丙二醛(MDA)的含量。结果 与正 常组比较,模型组小鼠血清中ALT、AST和LDH活性明显升高,肝脏组织出现明显的肝细胞变性坏死;大蒜素各剂 量组小鼠血清中ALT、AST和LDH活性与模型组比较显著降低,肝脏组织病理损伤明显减轻, GSH /GSSG比值增高, MDA含量下降。结论 大蒜素对
3、DMF引起的小鼠急性肝损伤具有明显的预防作用。 关键词:大蒜素;二甲基甲酰胺;急性肝损伤 中图分类号: R99413 文献标识码: A 文章编号: 1002 - 221X(2008) 03 - 0144 - 04 Protective effect of allici n on acute liver injury i nduced byN, N2dimethylformam ide XI NG Guo2zhen, J I A Feng2lan, RUAN Ming, ZHANGBao2xu3 (Departm ent of Toxicology,School of Publiec Healt
4、h, Beijing University, Beijing100083, China) Abstract: Objective To study the preventive effect of allicin on acute liver injury induced byN,N2dimethylformamide (DMF)in mice. M ethodsAn experimental hepatotoxic injurymodelwasmade by injection ofDMF to investigate the preventive effect of allicin.The
5、 dosages of allicin used in this experiment were 715, 15, 30 mg/kg,for 5 days,the DMF (218 g/kg) was given 30 min later after allicin administration at the 4th day, 48 h later after injection ofDMF,the serum were taken for the measurement of the activities of alanine aminotransferase (ALT) , asparta
6、te aminotransferase (AST)and lactate dehydrogenase (LDH) , and the liver tissues were taken for histopathological examination (HE staining)by light microscope.The ratio of GSH /GSSG and the contentofmalondialdehyde (MDA)in liver homogenateswere also detected at the same ti me. Results The results sh
7、owed that administration ofDMF,the serum activitiesofALT, AST andLDH were significantly increased, and the de2 generation and necrosis could be seen in liver tissue. While in allicin pretreasted group,the serum activities of these enzymes were dominantly lower than thatofDMF group,the histopathologi
8、cal changes in liverwere also significantly ameliorated afterpre2 treatment of allicin.Additionally,the ratio of GSH /GSSG in liver homogenate was also increased,the contents ofMDA, how2 ever, wasmarkedly reduced aswell in all allicin pretreated.Conclusion Allicin has definite preventive effect agai
9、nstDMF2in2 duced acute hepatotoxic injury in mice. Key words: Allicin;N, N2dimethylformamide; Acute liver injury 二甲基甲酰胺(N,N2dimethylfor mamide, DMF) 作为一种良好的有机溶剂,广泛应用于纤维、皮革、 染料及制药等工业生产中,随着现代工业的发展, DMF使用量逐年增加, DMF中毒事故也屡见不 鲜 14。急性中毒发生原因多数由于生产故障、设备 漏裂或在检修设备时未采取有效的防护措施,大量接 触DMF蒸气所致。主要表现为消化系统症状,以肝 损害最明显,血
10、清丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬 氨酸氨基转移酶(AST)活性增高 5 ,碱性磷酸酶活 性增高和血浆胆碱酯酶活性轻度增高,肝细胞脂肪变 性和坏死 6。目前对 DMF中毒尚无特效解毒剂,因 此,开发拮抗DMF所致肝脏损伤的药物尤为重要。 大蒜素(allicin)是大蒜中主要活性成分之一, 具有抗炎、抗病毒、抗氧化、增强免疫以及降压、降 血脂等作用。目前临床上应用的大蒜素主要有大蒜素 肠溶片、大蒜素胶丸剂和大蒜素注射液3种,可治疗 菌痢和肠炎,亦用于肺部和消化道白色念珠菌等真菌 感染。本研究通过DMF导致的急性肝损伤模型检测 了大蒜素对DMF引起的急性肝损伤的保护作用。 1 材料和方法 1.1
11、药品与仪器 大蒜素(三硫二丙烯,化学结构式见图 1) 为几 乎无色或淡黄色澄清液体,具蒜臭,纯度9812% , 441中国工业医学杂志 2008年6月第21卷第3期 Chinese J IndMedJune 2008, Vol .21 No.3 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 密度11108 g/ml,折光率11587,江苏清江药业有限 公司提供(批号:061129) ,用时以玉米油配成; DMF: ACROS公司提供(批号: A018522301) ,用 生理
12、盐水配制;还原型谷胱甘肽( reduced glutathi2 one,GSH)和N2 乙基顺丁烯二酰亚胺(N2ethylma2 thione, NEM I) :上海丽珠东风生物技术有限公司出 品;氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione,GSSG) : 北京红星生化技术公司出品;邻苯二甲醛(O2phthal2 dehyde, OPT) :北京金龙化学试剂有限公司出品; 018%硫代巴比妥酸(TBA) : ACROS公司提供。H I2 TACH I27170A型全自动生化分析仪, H ITACH I公司 生 产;日 本N IKON公 司,E400显 微 镜 系 统, DXM12
13、00F型摄像系统; 751分光光度计。 图1 大蒜素的化学结构 112 动物分组及处理 11211 实验动物 健康I CR小鼠(清洁级) 60只, 雄性,起始体重2224 g,由北京大学医学部实验动 物中心提供 SYXK (京) 200220002 。实验前5只 一笼饲养3 d以适应环境。动物室和实验室温度为 (23 2) ,自动通风,明暗周期12 h/12 h,自由摄 食饮水。饲料为北京大学医学部实验动物中心提供的 普通饲料。 11212 动物分组及处理 将60只小鼠随机分为6 组:正常对照组、大蒜素(30 mg/kg)组、DMF染 毒组、DMF染毒+ 3个剂量大蒜素预防性给药组 (7 15
14、、15和30 mg/kg) ,每组10只,每天上午8: 00 9: 00皮下给予小鼠大蒜素,各组小鼠每天给药时 间相同;共5d,每天1次,其他组皮下给予等体积 玉米油。给药第4天除对照组和大蒜素组外,染毒组 和3个预防性给药组经腹腔( ip)给予DMF (218 g/ kg) 。DMF染毒48 h后,所有动物内眦静脉取血,制 备血清用于ALT、AST和乳酸脱氢酶(LDH)的检 测。脱臼处死,立即解剖取肝脏,称重。留取50 mg 肝组织匀浆用于GSH、GSSG和丙二醛(malondialde2 hyde, MDA)的测定;将肝左叶浸于 10%甲醛溶液 中固定,进行常规病理切片, HE染色,光镜下
15、观察 病理组织学变化。 113 生化分析和病理学分析 使用7170A自动生化分析仪分析血清中ALT、AST 和LDH活性(由北京大学第三医院检验科测定)。用改 良Hission方法 7分析 GSH和GSSG的含量,并计算两 者的比值(GSH/GSSG)。肝脏中MDA含量用T AB反应 法 8检测。 114 统计学分析 实验数据以xs表示,用SPSS1110软件包对各 组间进行单因素方差分析,P0105认为差异有统计 学意义。 2 结果 211 对小鼠体重、肝重和肝体比的影响 与对照组比较,大蒜素组小鼠体重略有下降,肝 重和肝体比无变化; DMF染毒组体重下降,肝重变 化不明显,肝体比略有增加;
16、大蒜素预防性给药3个 剂量组与DMF组比较,体重有所下降,肝重和肝体 比变化不明显(表 1) 。 表1 大蒜素对正常小鼠与DMF染毒小鼠体重、肝重和 肝体比的影响 组 别体重(g)肝重(g) 肝体比( 100) 对照组28141181185012261500144 大蒜素组261411431163012161010152 DMF组261311531190012371200168 大蒜素715 mg/kg预防组27102163 # 2100013271360152 大蒜素15 mg/kg预防组25191163 3 # 1184012271090153 大蒜素30 mg/kg预防组24193103
17、 3 # 1167013561691113 与对照组比较,3P0105,3 3P0101;与DMF染毒组比较, #P0105,#P0101 212 对小鼠血清中ALT、AST和LDH活性的影响 与对照组比较,大蒜素组小鼠血清ALT、AST和 LDH活性与正常水平接近; DMF组ALT、AST和LDH 活性显著升高;大蒜素预防给药3个剂量组与DMF组 比较,血清中ALT、AST和LDH活性显著降低,且存 在剂量 2 反应关系(r= - 01846,P0105) ,大蒜素高 剂量组血清酶活性已经接近正常水平(图 2) 。 图2 大蒜素对正常小鼠与DMF染毒小鼠血清酶的影响 213 对小鼠肝脏GSH
18、 /GSSG比值和MDA的影响 与对照组比较, DMF染毒组小鼠肝GSH /GSSG 541 中国工业医学杂志 2008年6月第21卷第3期 Chinese J IndMedJune 2008, Vol .21 No.3 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 比值无明显变化;大蒜素预防性给药3个剂量组与 DMF组比较,肝GSH /GSSG比值增加;大蒜素组与 DMF组比较差异有统计学意义。 与对照组比较,大蒜素组肝MDA含量明显下 降, DMF组小鼠肝MDA含量明显增
19、加;大蒜素预防 性给药3个剂量组与DMF组比较,肝中MDA含量显 著下降至正常水平(表 2) 。 表2 大蒜素对正常小鼠与DMF染毒小鼠肝GSH /GSSG 比值和MDA含量的影响 组 别GSH /GSSGMDA ( g/g) 对照组611501970135501203 大蒜素组6169216201112010973 # DMF组6155113001688014353 大蒜素715 mg/kg预防组7160210101307012183 # 大蒜素15 mg/kg预防组618721960129101080# 大蒜素30 mg/kg预防组816511963 # 0126601109# 与对照组比
20、较,3P0105;与DMF模型组比较,#P0105,# P0101 214 对肝组织病理组织学的影响 对照组小鼠肝脏颜色正常,红褐色、湿润,有光 泽,富于弹性;光学显微镜下可见肝小叶轮廓清晰, 肝细胞胞质丰富,含嗜碱性物质较多,核大而圆,核 仁清晰(图31 A) 。大蒜素组小鼠肝脏大体和切片表现 均接近正常对照组(图31 B) 。DMF组肝脏大体主要 表现为灰黄色点状坏死灶,分布尚均匀,表面无光泽, 质地稍脆,光学显微镜观察肝脏切片可见肝脏小叶中 央静脉周围细胞坏死,且轮廓不清,胞核固缩或已溶 解破碎,肝细胞索正常形态破坏,中间带可见细胞空 泡样变及炎症细胞浸润(图31 C) 。大蒜素不同剂量
21、预 防组肝脏大体和切片与DMF组相比有明显改善(图 3.D、E、F) ,随着大蒜素剂量的增加,肝细胞变性、 肿大等病理损伤逐渐减轻,肝细胞索形态逐渐恢复, 30 mg/kg大蒜素预防组的肝脏组织结果已经接近正常 对照组(图31 F) 。 3 讨论 大蒜素对四氯化碳等 911 致小鼠急性肝损伤的 保护作用已有报道,但对于DMF致小鼠急性肝损伤 的预防作用至今未见报道。本研究结果表明,小鼠给 予DMF 48 h后,体重明显下降,血清中ALT、AST 和LDH活性显著升高,肝脏组织出现明显的肝细胞 变性坏死,提示DMF已对小鼠造成严重的肝损伤。 DMF确切的中毒机制尚未完全阐明,但有学者认为 主要与
22、DMF代谢生成的亲电中间代谢产物异氰酸甲 酯(NMF)有关 12 ,当NMF大量生成时,一部分和 肝细胞大分子结合,破坏其结构和功能,造成肝细胞 损伤;另一部分可和GSH结合生成S2 (N 2 甲基氨甲 酰)谷胱甘肽( S MG) ,最后再转化为巯基尿酸 (AMCC)而排出体外。急性DMF中毒还与体内的氧 化/抗氧化酶系的平衡状态 13 、钙超载引起的线粒体 损伤 14 以及这些过程中产生过多活性氧有关。 此次研究表明,预防性给予大蒜素可显著降低 DMF中毒导致的血清ALT、AST和LDH活性升高, 641中国工业医学杂志 2008年6月第21卷第3期 Chinese J IndMedJune
23、 2008, Vol .21 No.3 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 肝脏病理表现也有明显改善,表明预防性给药对 DMF所致的小鼠急性肝损伤具有明显的预防作用。 Miron等 15 认为大蒜素在体内主要是提供巯基 ,促进 GSH生成。本次研究观察到预防性给药可以降低肝 脏MDA含量,提高GSH /GSSG比值,说明大蒜素对 DMF致肝损伤的预防作用是通过GSH实现的。但本 研究没有观察到模型组GSH和GSSG的明显变化, 可能是48 h的观察终点DMF组肝细胞
24、中的谷胱甘肽 变化已恢复之故 16 。 大蒜素作为一种天然的护肝、抗氧化剂,在对 DMF引起的急性肝损伤保护作用中具有一定的开发 潜力。本研究为指导DMF接触人群强化服用含有大 蒜素的食品进行中毒预防提供了一定的理论依据。 参考文献: 1 杨水莲,周蓓颖,江朝强,等.职业性急性二甲基甲酰胺中毒的 临床分析J .中国工业医学杂志, 2000, 13 (4) : 2122214. 2 张国权.二甲基甲酰胺急性中毒68例临床分析 J .现代中西 医结合杂志, 2005, 14 (6) : 7762777. 3林丽婵.77例急性二甲基甲酰胺中毒的护理体会J .中国职 业医学, 2003, 30 (3)
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