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1、实验二 微生物接种技术一、目的微生物接种技术就是在灭菌条件下，用接种工具（针、环）从一支原菌种中挑取少许菌体，接入到另一支新的培养基上进扩大培养的技术。了解学习灭菌操作技术；掌握斜面接种技术。二、原理接种就是在灭菌条件下，用接种工具（针、环）（如图3-1）从一支原菌种中挑取少许菌体，接入到另一支新的培养基上进扩大培养的技术。接种就是在灭菌条件下，用接种工具（针、环）从一支原菌种中挑取少许菌体，接入到另一支新的培养基上进扩大培养的技术。我们要想得到大量的菌种，适应生产，科研和教学要求，就要进行微生物的接种，扩大菌种数量。接种因使用不同容器、不同的培养基，达到不同的目的，而有不同的接种方法，但是它
2、们的基本要求是相同的。通常接种都应在空气经过消毒灭菌过的“接种室”、或接种箱或超净工作台内进行。三、材料、试剂与器具1 材料 苏云金杆菌斜面菌种，牛肉膏蛋白胨斜面培养基。2 试剂 75%酒精或1：50的新法尔天水溶液。3 超净工作台，接种针（环），接种工具（如图3-1）、酒精灯等。图3-1 接种工具A. 接种环；B.接种针；C.接种钩；D.接种铲；E.F.玻璃涂布器四、操作步骤（一）准备工作1接种或接种室使用前半天先擦洗干净，然后每立方米体积用510毫升福尔马林盛在容器中加热熏蒸或者是用1/10的福尔马林重量的高锰酸钾加到盛有福尔马林的容器中，不用加热，亦可进行熏蒸；也可用5%的石炭酸喷务灭菌
3、；用紫外灯照射2030min。也可达到灭菌的目的。应注意，要把接种时要所需的用具（如接种针（环），酒精灯等）及培养基放入接种箱（室）一起灭菌消毒，但是菌种不能放入，以免死。超净工作要预先通风，紫外线照射30min方可使用。2进入接种室前先把手洗净，再用75%酒精或新洁尔灭擦两手，菌种试管表面同样要用酒精或新洁尔灭抹擦后才放入接种室（箱内）。（二）接种技术1、斜面菌种接种技术（从斜面培养基上的菌种接种至另一新的斜面培养基上的方法）。（1）准备工作就绪后，点然酒精灯。（2）将菌种和斜面培养基的两支试管用大拇指和其他四指握在左手中，使中指拉于两试管之间的部分，斜面向上，并使它们拉于水平位置，也可将试
4、管放在左手掌中，用手指托住试管。（3）先将棉塞用右手拧转松动，便以接种时拔出。（4）右手拿接种环（拿的方法就和拿钢笔一样），在火焰上将环的部分烧红灭菌。环以上凡是在接种时可能进入试管的部分，均应用火烧过（如图3-2）。以下操作都要把试管口靠近火焰旁进行。（5）用右手小指、无名指和手掌拔掉棉塞（如图3-2）。（6）用火焰灼烧管口，灼烧时应不断转动试管口（靠手腕的动作，使试管口沾染的小量菌得以烧死）。（如图3-2）。（7）将烧过的接种针（环）触动没有长菌的培养基部分，使其冷却，以免烧死被接种的菌体，然后轻轻接触菌体，取出少许，慢慢将接种针（环）抽出试管（如图3-2）。（8）迅速将接种针（环）在火焰
5、旁无菌区伸进另一试管，在培养基斜面上轻轻划线，在上面接细菌，划线时要由底部划到顶部，由上而上，划线可划之字形，或划几条直线，但都不要把培养基划破，也不要使菌种沾污管壁（如图3-2）。（9）将接种针（环）抽出，灼烧试管口，并在火焰旁将棉塞塞上。塞棉塞时，不要用试管去迎棉塞，以免试管在运动时纳入不洁空气（如图3-2）。（10）把针（环）在火焰上再灼红灭菌，放下接种钟（环）后，再腾出手来将塞塞紧。（如图3-2）。（11）全部培养基接种完毕后，要将试管斜面培养基包扎好，并标明姓名、时间和菌种名称；整理好接种室（箱）的台面，搞好清洁卫生。2、液体接种技术（由斜面菌接入液体培养基内或液体菌种接入液体培养基
6、）（1）准备工作和操作方法与前相同，但可使试管向上略斜，以免培养液流出。（2）将取得菌种的接种环送入液体培养基时，可使环在液体表面与管壁接触的部分轻轻摩擦。接种后塞棉塞，将试管在手掌中轻轻摇动，使菌体在培养基中分散开来。（3）由液体菌种接种液体培养基时，接种用无菌滴管或移液管，接种量通常为培养液体积的1/10。无菌操作的注意事项与前相同，只是移液管不同于接种针，系由玻璃做成，它不能在火焰上灼烧，接种前在火焰上迅速通过一两次即可。3、穿刺接种技术（深层柱形固体培养基的接种技术）（如图3-3）（1）取两支新鲜半固体牛肉膏蛋白胨深层柱状培养基，做好标记（写上菌种名、接种日期和接种人等）。（2）接种的方法是，用接种针沾取少量待接菌种，然后从柱状培养基的表面中心穿入其底部（但不要穿透），然后沿原刺入路线抽出接种针，注意接种针不要移动。以上接好种的材料置于30下培养2448h。图3-3 穿刺接种技术五、注意事项1、菌种取出后，接种针（环）不要通过火焰、以免烧死菌体。2、斜面接种时，不要使接种针（环）的碰到管壁；不要划破培养基，但也不能在试管空间划，一定要接触到斜面表面上划线接种。3、接种前的准备和接种过程都要有无菌概念。六、实验报告培养后取出试管，观察划线接种效果、菌种生长情况，检查是否有杂菌生长，评价无菌操作的效果。七、思考题微生物接种时，通过哪些措施可防止杂菌污染？