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1、论著 抗肾小球基底膜病患者血清自身抗体的异质性 及其临床病例的相关性分析 刘畅 ， ，曲贞，杨瑞，赵娟，贾晓玉，郑欣，刘章锁，崔昭 ，赵明辉 （ 北京大学第一医院肾内科， 北京 ； 郑州大学第一附属医院肾内科） 摘要目的： 研究抗肾小球基底膜（ ， ） 病患者血清自身抗体的异质性及其临 床病理的相关性。方法： 选取北京大学第一医院肾内科 年 月至 年 月收治的有完整临床及肾活检资 料的 例抗 病患者为研究对象。收集就诊时的血清或血浆置换液用于孵育正常人肾组织冰冻切片行间接 免疫荧光检查。隐匿性抗原表位的暴露采用 尿素对组织切片进行预处理， 天然抗原表位的检测则以未经 处理的组织切片作为底物。抗
2、体滴度的检测由 至 。根据间接免疫荧光的结果决定抗体是否识别不同抗 原表位， 并进一步分析识别不同抗原表位与临床表现的相关性。结果： 例患者血清或血浆置换液均识别隐匿性 抗原表位（ 尿素处理后肾组织） ， 间接荧光显示抗体沿 呈线条样沉积， 其中 例（ 组） 也识别天然暴露 的抗原表位（ 非处理肾组织） ， 其余 例（ 组） 则不识别天然暴露的抗原表位。虽然 组血清可识别天然暴 露的抗原表位， 但是该组血清识别隐匿性表位的平均滴度明显高于 组（ ） ；组患者合并抗中性粒细胞 胞浆抗体（ ， ） 的比例则明显低于 组（ ） 。两组患者就诊时的其 他临床指标（ 包括血肌酐水平） 和肾病理指标差异则
3、无统计学意义。结论： 所有患者血清抗 抗体识别 上 隐匿的抗原表位， 但近一半患者的抗体同时识别天然暴露的抗原表位。识别天然暴露抗原表位者其血清识别隐匿 性抗原的滴度更高， 血清 阳性的几率显著减少。 关键词肾小球基底膜；自身抗体；抗原；抗体， 抗中性白细胞胞质；荧光抗体技术， 间接 中图分类号 文献标识码 文章编号 （ ） ： 基金项目：高等教育博士学科点专项科研基金新教师基金（ ） 和北京市自然科学基金（ ） 资助 （ ） ， （ ） ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， （ ， ， ， ； ， ） ： ： ， ， （ ） ， ； ： （ ） ， （ ） （ ） ； （ ） ， （ ）
4、， （ ） （ ） 北京大学学报（ 医学版） （ ） ： ， ， ； ； ； ， ； ， 抗肾小球基底膜 （ ， ） 病是一种少见但严重的自身免疫性疾 病。它主要累及肾和肺组织， 肾受累多表现为急进 性肾小球肾炎， 多进展为终末期肾衰竭 ； 肺受累 表现为肺出血， 两者同时累及被称为 病 。抗 病是以体内出现抗 抗体为特 征。该抗体在 线样沉积不仅对疾病具有诊断 意义， 并且在发病机制中有重要作用。型胶原是 的重要组成成分， 生理状态下以六聚体的形式 存在。抗 抗体的主要靶抗原位于肾和肺组织 基底膜型胶原的 链非胶原区 （ ） ， 其两个主要的抗原表位（ ） 分别为 和 ， 隐匿于 （ ） 的
5、立体结构中 ， 只 有六聚体解聚才能使完整的抗原表位暴露。体外实 验证实应用高浓度低 值变性剂， 如十二烷基硫 酸钠（ ） 、 尿素或者盐酸胍均可以使六聚体解聚； 而在体内， 吸烟、 氧化应激等可能是导致六聚体解聚 的危险因素， 并且抗 抗体本身也有使六聚体解 聚的作用 。国外的研究认为抗 病患者血清 中的自身抗体所识别的抗原表位（ 包括 和 ） 均为隐匿性的， 不存在天然暴露的抗原表位 ， 但 早期应用间接免疫荧光（ ） 的研究发现部分患者 血清可以识别正常肾组织的 ， 提示正常肾组织 可能存在天然暴露的抗原表位， 部分患者血清中的 自身抗体可以识别暴露的抗原表位 ， 但其临床意 义并不清楚
6、，而那些不识别正常肾组织的血清， 在 应用尿素处理肾组织使其中隐蔽的抗原表仪暴露则 后， 可以识别。北京大学第一医院肾内科拥有国际 上最大的抗 病的标本和资料库， 这为我们明确 抗 抗体是否识别天然暴露的抗原表位提供了 可能。我们推测部分患者的抗 抗体可以识别 天然暴露的抗原表位， 而且识别不同表位的抗 抗体在发病机制中可能发挥不同作用。 资料与方法 研究对象 本研究纳入北京大学第一医院肾内科 年 月至 年 月收治的有完整临床及肾活检资 料的 例抗 病患者； 所有患者血清经商品化 的 试剂盒（ ，德国， 货号 ） 证实为抗 抗体阳性， 患者就诊时的血 清或血浆置换液在 保存。 收集患者所有临床
7、、 病理及实验室检查资料作 回顾性分析。肾活检时 以上肾小球出现大新 月体诊断为新月体肾炎。多系统受累定义为除肺肾 受累以外， 另有至少一个脏器受累。本研究中肾生 存指起病后 年时不依赖透析。 材料 正常人肾组织来自北京大学第一医院泌尿外科 提供的肾盂癌切除术远离肿瘤的正常肾皮质； 正常 人肾组织 冰冻切片， 预冷丙酮固定， 保 存； 兔抗人 标记的荧光二抗购自丹麦 公司（ 货号 ） 。 所有参与研究者均签署知情同意书。 方法 间接免疫荧光（ ） 法检测识别天然暴露抗原表 位的自身抗体： 冰冻切片室温放置 ， 磷酸盐缓冲液（ ） 洗涤（ ） ； （ 质量分 数） 牛血清白蛋白（ ） 孵育封闭，
8、 ； 患 者血清或血浆置换液（ 滴度从 至 ） 孵育， ； 洗涤（ ） ； 兔抗 人 标记的荧光二抗（ ） 孵育， ； 洗涤（ ） ； 荧光显微镜 阅片， 沿 出现线条样沉积的荧光视为阳性， 否 则视为阴性。 隐匿性抗原表位的暴露及相关自身抗体的检 测： 将肾组织切片在 封闭前应用 尿素 （ ） 室温孵育肾组织 ， 余步骤同前。以 正常人血清和 替代一抗为阴性对照。 统计学分析 计量资料符合正态分布的连续变量应用独立样 本 检验， 结果采用 珋 表示； 不符合正态分布的非 连续变量应用非参检验， 结果采用中位数（ 下限， 上 限） 表示。计数资料应用四格表卡方检验， 取 精确概率法的 值。用
9、软件进行统计分 析， 认为有统计学差异。 结果 人口学及临床资料（ 图 ） 研究纳入 例抗 病患者， 其中男性 北京大学学报（ 医学版） （ ） 人， 女性 人； 中位数年龄 岁（ 岁） ； 至 岁之间呈现一个以男性患者为主的发病高峰 （ ） 。 图 例抗 病患者的人口学资料（ 年龄和性别比例） （ ） 临床资料中， 人（ ） 出现肉眼血尿； 人 （ ）诊 断 时 血 清 肌 酐 大 于 ； 人（ ） 出现肺出血， 人（ ） 合并 阳性。 肾活检病理资料中， 人（ ） 出现新 月体肾炎； 人（ ） 肾活检直接荧光可见 沿 呈线条样沉积。 间接免疫荧光检查及其滴度 份患者血清均识别尿素处理后的正
10、常人肾 组织， 间接免疫荧光检查呈现 线条样沉积于 （ 图 ） ， 提示所有患者的抗 抗体均识别 隐匿性的抗原表位。但是 患者血清也同时 识别未经尿素处理的正常人肾组织， 间接免疫荧光 检查亦呈现 线条样沉积于 （ 图 ） ， 提示 这些患者的抗 抗体也可识别天然暴露的抗原 表位， 该组患者定义为 组； 其余 不能识别 未经尿素处理的正常人肾组织， 间接免疫荧光检查 未见任何荧光沉积（ 图 ） ， 提示这些患者的抗 抗体不能识别天然暴露的抗原表位， 该组患者 定义为 组。 （ ， ， ） （ ， ， ） ， ， ； ， ， ； ， ， ； ， ， ； ， ， ； ， ， 图 在正常人肾组织行间
11、接免疫荧光检测患者血清中的抗 抗体 （ ） （ ） 组患者的自身抗体不但可识别天然暴露的抗 原表位， 其识别隐匿性抗原表位的平均滴度还显著 高于 组患者的自身抗体（ 中位滴度 ， ， 表 ） 。 不同自身抗体类型的临床意义（ 表 ） 组患者中女性比例、 合并 的比例， 以及 多系统受累的比例均显著低于 组（ ， ， ） ， 临床呈现肉眼血尿的比例显著高 于 组（ ） ， 但是两组患者在就诊时的血肌 酐值、 合并血尿、 合并蛋白尿、 合并少尿以及肾生存 等方面差异均无统计学意义（ ） 。 不同自身抗体类型的肾病理学意义（ 表 ） 组患者肾活检直接荧光出现典型 线条样 沉积的比例显著高于 组（ ）
12、 ， 但补体 沉 刘畅， 等抗肾小球基底膜病患者血清自身抗体的异质性及其临床病例的相关性分析 积的比例差异则无统计学意义（ ） 。两组患 者肾活检时诊断为新月体肾炎的比例差异也无统计 学意义（ ） 。 讨论 本研究纳入的 例抗 病患者， 其人口学 资料基本符合本实验室既往关于中国抗 病患者 的特征分析 ， 由于入选条件要求有完整临床及病理 资料， 可能导致了老年患者相对减少， 没有出现合并 的女性在 岁左右的高峰。患者肾活检直接 免疫荧光检查， 有 例患者肾组织可能由于基底膜 破坏严重未见到典型的 线条样沉积， 但其血清可 识别经尿素处理的正常肾组织并呈现典型的线条样 沉积， 提示间接免疫荧光
13、法在直接荧光结果不典型时 可以辅助抗 病的诊断并提高诊断率。 表 两组患者血清识别隐匿性抗原表位的滴度及发生频率（ 例） 表 两组患者临床及病理资料比较（ 例） （ ） （ ） （ ） （ ） （ ） （ ） （ ） （ ） （ ） （ ） （ ） （ ） （ ） （ ） （ ） （ ） （ ） （ ） （ ） （ ） （ ） （ ） （ ） （ ） （ ） （ ） （ ） （ ） （ ） （ ） （ ） （ ） （ ） （ ） 抗 病虽然是一种少见的自身免疫性疾病， 但由于其病情重， 预后差， 一直被研究者及肾内科医 师所重视， 关于其发病机制及致病过程的研究逐渐 深入。虽然有动物实验表明自
14、身反应性 细胞是 致病的重要因素， 但抗 抗体的重要性从来没被 人们忽略， 而对抗 抗体靶抗原的研究在揭示其 发病机制方面尤为重要。发现抗 抗体的靶抗 原位于 （ ） ， 以及发现 和 两个主要 的隐匿抗原表位是该病发病机制研究中的重要里程 碑， 但抗原是如何触发免疫反应引起自身抗体产生， 目前还不清楚。由于抗原表位隐匿于型胶原的立 体结构中， 体外实验需要应用高浓度低 值的蛋 白变性剂（ 例如盐酸胍、 尿素） 才能使其充分暴 露 ， 因而研究者一直在寻找体内使抗原暴露从而 致病的始发因素。目前认为氧化应激、 吸烟及自身 抗体有可能参与了患者体内隐匿性抗原表位的暴 露。本研究中所有患者的血清都
15、识别隐匿性抗原表 位， 支持隐匿性抗原表位具有致病性的观点。但是 超过一半的患者血清也可识别非处理条件下的正常 人肾组织（ 组） ， 提示部分患者的自身抗体可以识 别 上天然暴露的抗原表位。我们推测， 识别天 然暴露的抗原表位可能是由于抗原表位扩散 北京大学学报（ 医学版） （ ） （ ） 的结果。抗 病发病过程中 可以发生抗原表位扩散已经在动物实验中证明 。 本实验室的前期研究发现， 抗 病的发病过程中 存在抗体亚型的扩散， 在疾病表型越重的患者， 扩散 现象越明显 。进一步的研究又发现肾受累较轻 的患者的血清主要识别胶原的 和 （ ） ， 但肾受累严重的患者的血清则可以识别型 胶原的所有条
16、 链， 说明在抗 病的进展过程 中确实存在型胶原分子间的抗原表位扩散 。 而 （ ） 分子内的抗原表位扩散尚有待进一 步研究证实。本研究中， 可识别天然暴露抗原表位 的患者（ 组） 血清， 其识别隐匿性抗原表位的自身 抗体的滴度更高， 与 结合的能力更强， 临床上 合并肉眼血尿的患者更多， 提示该组患者的免疫反 应更为严重。因此， 其识别天然暴露的抗原表位， 很 有可能是源于发生了抗原表位扩散， 这与我们前期 的研究结果一致。但是， 本研究中两组患者在就诊 时的血清肌酐、 肾预后等方面无显著差异。这一方 面说明 和 仍是最重要的抗原表位； 另一方 面， 可能是由于该病进展迅速， 而大多数患者就
17、诊较 晚， 错过了最佳治疗时机， 因此未能观察到两组患者 临床预后的差别。 我们在对临床及病理资料分析中发现， 抗 病患者大约 合并 阳性 ， 但是早期 研究已经证实 和抗 抗体在抗原表位上 没有交叉反应 ， 目前两种少见的自身抗体同时出 现的原因及二者出现的先后顺序一直没有定论。本 研究可能对其发生机制提供一些线索： 在本研究中， 自身抗体仅识别隐匿性抗原表位的患者（ 组） 中 合并 的比例显著高于同时识别隐匿性和天 然暴露抗原表位的患者（ 组） ， 提示 的出现 可能先于抗 病的发生， 其造成的肺和肾小血管 炎性病变可能导致型胶原隐匿性抗原位点的暴 露， 导致了仅识别隐匿性抗原表位的自身抗
18、体的产 生而诱发抗 病。两组患者在性别比例及多系 统受累的差异与 的分布一致， 可能与合并 相关， 尚需进一步研究。两组患者在反映病 情的其他指标及预后方面没有显著差异， 可能是由 于大部分患者未能得到早期诊断， 未能及时给予有 效的治疗所致。因此， 临床工作者对抗 病的认 识尚待提高。 参考文献 ， ， ： ， ， ， ， （ ） ： ， ， ， （ ） ， ， （ ） ： ， ， ， （ ） （ ） ， ， （ ） ： ， ， （ ） ： ， ， ， （ ） ， ， （ ） ： ， ， ， ， ， （ ） ： ， ， ， ， ， （ ） ： ， ， ， ： ， ， （ ） ： ， ， ， ， ， （ ） ： ， ， ， （ ） ， ， （ ） ： ， ， ， ， ， （ ） ： ， ， ， ， ， （ ） ： ， ， ， ， ， （ ） ： ， ， ， ， ， （ ） ： （ 收稿） （ 本文编辑：王蕾） 刘畅， 等抗肾小球基底膜病患者血清自身抗体的异质性及其临床病例的相关性分析