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1、酶联免疫法测定食品中黄曲霉毒素酶联免疫法测定食品中黄曲霉毒素 一一、实验实验目的目的 了解 ELISA 的基本原理，及其优缺点； 掌握间接 ELISA 法的试验操作过程。 二二、实验实验原理原理 酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，简称 ELISA）是免疫酶 技术的一种。本方法测定的基础是抗原抗体反应，微孔板包被有针对黄曲霉毒素 B1 （Aflatoxin B1，AFB1）的特异性单克隆抗体，加入黄曲霉毒素标准品（或样品溶液） 及黄曲霉毒素 B1 酶标记物，标准品（或样品溶液）中的游离黄曲霉毒素 B1 与黄曲霉 毒素 B1 酶标记物竞争黄曲霉毒
2、素 B1 抗体，没有连接抗体的酶标记物在洗涤步骤中被 除去。将基质/发色剂加入到孔中并且孵育，结合的酶标记物将基质/发色剂转化为蓝色 的产物，加入反应停止液后使颜色由蓝转变为黄色，在 450nm 处测量，吸收光强度与 样品中黄曲霉毒素 B1 的浓度呈负相关。 三三、实验器材实验器材 1、ELISA 试剂盒试剂盒 其组成如下： 1.1 包被抗体的反应板包被抗体的反应板 48 孔 1.2 A 试剂：样品稀释液 l 瓶 1.3 B 试剂：AFB1 标准溶液 l 套(0, 0.1, 0.25, 0.5, 1, 2 ng/mL) 1.4 C 试剂：酶标抗原 l 瓶 1.5 D 试剂：酶标抗原稀释液 l
3、瓶 1.6 E 试剂：浓缩洗涤液 l 瓶 1.7 F 试剂：显色底物液 a l 瓶 1.8 G 试剂：显色底物液 b l 瓶 1.9 H 试剂：终止液 l 瓶 1.10 反应板框架 l 块 2、仪器仪器 1.1 酶标仪(内置 450nm 滤光片) 1.2 50L 微量移液器及配套吸头 1.3 恒温培养箱(0-50) 1.4 冰箱(4-8) 1.5 感量 0.0lg 的天平 1.6 调速振荡器或超声波清洗器 1.7 离心机 5000r/min 1.7 玻璃器皿：具塞锥形瓶，烧杯，分液漏斗，普通漏斗，量筒，具塞试管，滴管，移 液管等 1.8 小型粉碎机或碾钵 1.9 其它：滤纸，吸水纸等 四、实验
4、步骤四、实验步骤 1、实验准备实验准备 1.1 样品处理：详见试剂盒说明书所列“样品处理方法”及“黄曲霉毒素国家允许量标 准及样品稀释表” 1.1.1 脂肪含量小的固体样品(如大米、玉米、小米等) 称取 5.0g 样品(已粉碎)于 100mL 具塞三角瓶中，准确加入 25.00mL 甲醇水(1+1) 溶液，于振荡器上剧烈震荡 15min，过滤，弃去 l/4 初滤液，收集试样滤液，此液为样 品提取液。根据样品的国家允许量标准，用 A 试剂(样品稀释液)将样品提取液进行适 当稀释（如 100L 样品提取液+100L 样品稀释液，总稀释 10 倍） ，即为待测样液。 1.1.2 花生 样品去皮粉碎(
5、刀切或剪切)，称取 5.0g 于 100mL 具塞三角瓶中。加入 25.0mL 甲 醇水(1+1)溶液和 20mL 正已烷(或石油醚)，于振荡器上剧烈震荡 l0min，过滤于分液漏 斗中，静置分层，放出下层甲醇水提取液，此液为样品提取液，根据样品的国家允许 量标准，用 A 试剂(样品稀释液)将提取液进行适当稀释（如 100L 样品提取液+300L 样品稀释液，总稀释 20 倍） ，即为待测样液。 1.1.3 一般饲料及原料 称取 5.0g 样品于 100mL 具塞三角瓶中，准确加入 25.0mL 甲醇水(1+1)溶液，于振 荡器上剧烈震荡 15min，过滤，弃去 1/4 初滤液后收集滤液，此液
6、为样品提取液。根据 样品的国家允许量标准， 用 A 试剂(样品稀释液)将样品提取液进行适当稀释 （如 100L 样品提取液+900L 样品稀释液，总稀释 50 倍） ，即为待测样液。 1.2 试剂的配制试剂的配制 1.2.1 每瓶 C 试剂（酶标抗原）中准确加入 1.5mL D 试剂(酶标抗原稀释液)，充分溶解， 配成实验用酶标抗原溶液，28保存。 1.2.2 取适量 E 试剂(浓缩洗涤液)用超纯水稀释 20 倍待用。例如：取 3mL E 试剂(浓缩 洗涤液)，加 57mL 超纯水，混匀后制成实验用洗涤液，足够 24 孔使用。 2、操作、操作步骤步骤 2.1 试剂平衡：试剂平衡：将测试盒于室温
7、中放置 15min 以上，平衡至室温。 2.2 小孔编号：小孔编号：根据实验需要截取相应孔数放置反应板框架上。设定 l 号孔为仪器调 零孔，2-7 号孔为 AFB1标准对照孔，其余孔为样品孔。 2.3 洗涤：洗涤：每孔加入 250L 左右洗涤液， 洗涤液不得溢出， 放置 1min 后， 甩掉洗涤液， 在吸水纸上拍干，重复洗板一次。 2.4 反应组成：反应组成：按下列步骤所示（见表 1） ，依次加入配制好的溶液及待测样液。 第一步：l 号孔加入 50L A 试剂(样品稀释液)，2-7 号孔分别加入系列的 B 试剂 (AFB1标准溶液：0，0.1，0.25，0.5，1，2ng/mL) 50L，其余
8、孔加入相应的待测样液。 第二步：l 号孔加入 50L D 试剂(酶标抗原稀释液)，其余各孔均加入 50L C 试 剂（酶标抗原溶液） 。 第三步：轻轻地振摇，使各孔中的反应物混合均匀。 表表 1 反应物组成反应物组成 操作次序 加入量 孔 号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 50 L A 0 0.1 0.25 0.5 1 2 待测样液 2 50 L D C C C C C C C C C C C 3 混 匀 2.5 反应：反应：将反应板放入 37恒温培养箱中孵育 30min。 2.6 洗涤：洗涤：取出反应板，用力甩掉反应液，拍干。每孔加入 250L 左右洗涤液，洗涤
9、液不得溢出，放置 2min 后，甩掉洗涤液，在吸水纸上拍干，重复洗板 4 次。 2.7 显色：显色： 每孔分别加入 F 试剂(显色底物液 a)和 G 试剂(显色底物液 b)各 50L， 摇匀， 将反应板放入 37恒温培养箱中显色 15min。 2.8 终止与仪器测定：终止与仪器测定：每孔分别加入 H 试剂（终止液)50L，摇匀后用酶标测定仪在 450nm 波长处测定各孔的吸光度 A 值。 3、试样测定与结果计算试样测定与结果计算 将系列 AFB1标准溶液(0，0.1，0.25，0.5，1，2ng/mL)测得的吸光度 A 值，绘制 成标准曲线(见示意图)。横坐标为标准液浓度的常用对数值(1gC)
10、，纵坐标为各标准液 孔 A 值与 0ng/mL 标准液孔的 A 值的比值(A（标准液）A（0ng/mL）（若同时有平行实验数据， 则 A 及 A0分别取其平均值，下同） 。 黄曲霉毒素 B 1标准曲线示意图(注：仅供参考) 计算待测样品孔 A 值与 A(0ng/mL)的比值(A样品/A（0ng/mL）)，查标准曲线，可得到相应 待测样液浓度(C)的常用对数值 lgC，对其求反对数，可求得待测样液的 AFB1浓度 C。 按下列公式计算出样品中 AFB1的含量： D m V CgngAFB=）含量（/ 1 式中： C：待测样液中 AFB1含量(ng/mL) V：样品提取液体积(mL) m：样品质量(g) D：样品稀释倍数