鸡传染性法氏囊病毒抗原捕获ELISA检测方法的建立及应用.pdf

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1、第2 8 卷第6 期 2 0 0 9 年1 2 月 上海交通大学学报( 农业科学版) J O U R N A LO FS H A N G H A IJ I A O T O N GU N I V E R S I T Y ( A G R I C U L T U R A LS C I E N C E ) V 0 1 2 8N o 6 D e c 2 0 0 9 鸡传染性法氏囊病毒抗原捕获E L I S A 检测方法的建立及应用 陈志飞- ，杜军2 ，汪振兴3 ，张强- ，王巧全- ，严亚贤，孙建和3 ，李树清- ( 1 上海出入境检验检疫局，上海2 0 0 1 3 5 ：2 新疆农业大学，乌鲁木齐8

2、 3 0 0 5 2 ： 3 上海交通大学农业与生物学院，上海2 0 11 0 1 ) 摘 要：为快速检测鸡传染性法氏囊病毒，使用纯化的鸡抗I B D V 多克隆抗体和鼠抗I B D V 单克隆抗体，建立了抗原捕获 E L I S A 检测鸡传染性法氏囊病毒的方法。使用建立的方法可以检测到h 1 6 0 倍稀释的I B D V 疫苗及阳性法氏囊组织中的病毒 检测禽流感、新城疫、鸡传染性支气管炎病毒及沙门氏茵、葡萄球茵、巴氏杆茵、大肠杆菌、肺炎球菌等结果均为阴性检测I B - D V 超强毒和疫苗毒人工感染鸡的法氏囊、脾、肝及临床样品7 8 份，检出阳性2 4 份，与R T P C R 检测结果

3、相符率为9 6 ( 7 5 1 7 8 ) 。说明建立的方法敏感、特异，可用于法氏囊病的诊断和监测 关键词：鸡传染性法氏囊病毒；抗原捕获E u s A ；检测 中图分类号：$ 8 5 5 3文献标识码：A D e v e l o p m e n ta n dA p p l i c a t i o no fA C - E L I S A f o r D e t e c t i o no fI n f e c t i o u sB u r s a lD i s e a s eV i r u s C H E NZ h i - f e i l ，D UJ u n 2 , W AN GZ h e n -

4、 x i n 9 3 ，Z H AN GQ i 彻一，W AN GQ i a o - q u a n l ， Y AN Y a - x i a n 3 ，S U NJ i a n - h e 3 , L IS h u - q i n g j ( 1 S h a n g h a iE n t r y - E x i tI n s p e c t i o na n dQ u a r a n t i n eB u r e a u ，S h a n g h a i2 0 0 1 3 5 ，C h i n a ；2 X i n j i a n gA g r i c u l t u r a lU n i

5、v e r s i t y ， U m m q i8 3 0 0 5 2 ，C h i n a ；3 S c h o o lo fA g r i c u l t u r ea n dB i o l o g y ，S h a n g h a iJ i a o t o n gU n i v e r s i t y ，S h a n g h a i2 0 11 0 l ，C h i 弛) A b s t r a c t ：n l eA n t i g e nC a p t u r eE n z y m e - L i n k e dI m m u n o s o r b e n tA s s a y

6、 ( A C E U S A ) W a gd e v e l o p e dw i t ht h ep u r i f i e dc h i c k e na n t i I B D Va n t i b o d i e sa n dm o u s ea n t i I B D VV P 2m o n o c l o n a la n t i b o d i e sf o rq u i c k l yd e t e c t i n gI B D V T h e1 1 6 0d i l u t e dv i m 眈si nt h eI B D V v a c c i n e sa n dt h

7、 ei n f e c t e db u r s ao ff a b r i c i u sc a nb eo b s e r v e d ，w h i l eo t h e rp a t h o g e n ss u c h 州，N D V ，I B V ，S a m o n e as p p ， S t a p h y l o c o c c u sa H r e u s 。P a s t e u r e U am u l t o c i d a , E s c h e r i c h i ac o l ia n dS t r e p t o c o c c u sp n e u m o

8、n i e ac a l ln o tb ef o u n db yt h eA C E L I S A 7 8 s a m p l e si n c l u d e dt h eb u r s ao ff a b r i c i u s ，s p l e e n s ，l i v e r sw h i c hw e r ee x p e r i m e n t a l l yi n f e c t e dw i t hv e r yv i r u l e n tI B D V ( v v l B D V ) a n d c l a s s i cv i r u s e si nt h ev

9、a c c i n e s ，w e r ea s s a y e d n er e s u l t ss h o w e dt h a t2 4s a m p l e sw e r ep o s i t i v ew i t h9 6 q s n 8 ) a g r e e m e n tb e t w e e n A C - E L I S Aa n dR T P C R ，w h i c hi n d i c a t i n gt h a tt h eA C E U S Aw i t hh i g hs e m i t i v i t ya n ds p e c i f i c i t

10、yc a nb eu s e dt od i a g n o 眈I B D K e yw o r d s ：i n f e c t i o u sb u r s a ld i s e a s ev i r u s ( I B D V ) ；A C E U S A ；d e t e c t i o n 鸡传染性法氏囊病( i n f e c t i o u sb u r s a ld i s e a s e 。 I B D ) 是由鸡传染性法氏囊病病毒( I B D V ) 弓I 起的一种 呈世界性流行的烈性传染病。该病主要侵害3 - 6 周 龄鸡的中枢免疫器官，引起免疫抑制。I B D 的流行

11、给 世界养禽业造成巨大经济损失，已成为危害养鸡业 的主要疫病之一。国内外学者对I B D 的诊断方法进 行了大量的研究。目前用于诊断I B D 的方法主要有 琼脂扩散试验( A G P ) 、荧光抗体试验( I F A l 、病毒中和 试验N ) 、酶联免疫吸附试验( E L I S A ) 、聚合酶链反 应( P C R ) 等【1 1 。E L I S A 是目前诊断I B D 应用最广的方 法之一，具有操作简单、特异、敏感、重复性好等特 点，是大规模检测I B D 抗体或抗原的理想方法。自 M a r q u a r d t 等首次建立间接E U S A 检测I B D 抗体以 来，国内

12、外学者相继进行了大量研究闭。陈明勇1 3 1 、贺 收稿日期：2 0 0 9 - 0 3 1 5 基金项目：上海市科委标准专项项目( 0 6 D Z 0 5 0 3 3 ) ；上海出入境检验检疫课题( H K 0 8 9 2 0 0 7 ) 作者简介：陈志飞( 1 9 6 4 一) ，男，兽医师，硕士，研究方向：进出口动物检疫；李树清为本文通讯作者，E m a i l ：l i 8 q s I I c i q 罢州 万方数据 第6 期 陈志飞，等：鸡传染性法氏囊病毒抗原捕获E L I S A 检测方法的建立及应用 5 4 9 荣莲1 4 1 等用包被与检测相同的抗I B D V 抗体建立了 双

13、抗体夹心E L S I A 方法，检出率高于A G P 。H a s s a n MK 等四将A C E L I S A 与传统方法进行对比，表明 A C E L I S A 较细胞培养、鸡胚接种方法适用性更强。 不仅对活病毒，对死病毒也可进行检测，不受样本含 毒量的限制。目前国外已有商品化的I B DE L I S A 诊 断试剂盒，但价格昂贵，未能广泛应用嘲。近年来国 内对I B D 的E L I S A 诊断试剂盒研究增多，但其敏感 性、特异性、重复性未达到国外同类产品水平，仍处 于试验阶段，真正成型的几乎没有m 。本文用纯化的 鸡抗I B D V 多抗包被来捕获病毒，用鼠抗I B D

14、VV P 2 ( 表达蛋白) 单抗来检测病毒，建立了一种快速、简 便、灵敏、准确的A C E L I S A 检测方法，为国内I B D E L I S A 商品化试剂盒的研制提供了实验依据。 1 材料和方法 1 1 材料 1 1 1I B D V 毒株及其他对照毒株、菌株I B D V S H 9 5 超强毒株( 上海交大生物技术研究所保存) ；疫 苗毒株B u r 7 0 6 、2 2 8 E 、D 7 8 、2 5 1 2 购于北京康牧公 司；疫苗株B 8 7 、B J 8 3 6 为上海市动物疾病控制中心 惠赠。I B D V 阳性毒株1 4 株( A V 系列1 ，购于中国兽 医药品

15、监察所。大肠杆菌0 1 5 7 、沙门氏菌、金黄色葡 萄球菌、鸡传支M 4 1 、新城疫L 、禽流感H 9 N 2 均为 上海交大农业与生物学院保存。 1 1 2 尿囊液6 份，江苏省农科院惠赠。 1 1 3S P F 鸡法氏囊山东农科院惠赠。 1 1 4 临床样品3 6 份，于2 0 0 8 年7 8 月购于上 海农贸市场。 1 1 5 实验室感染样品超强毒和疫苗毒人工感染 1 月龄鸡的法氏囊、脾、肝等组织以及鸡胚尿囊膜等 2 0 份。 1 1 6 鸡抗I B D V 标准阳性血清购于中国兽医药 品监察所，批号：2 0 0 7 0 7 。 1 1 7 鼠抗I B D VV P 2 单克隆抗体

16、哈尔滨兽医研 究所王笑梅研究员惠赠。 1 1 8 其他抗鼠碱性磷酸酶及底物P N P ( 对硝基 酚) 。 1 2 方法 1 2 1 鸡抗I B D V 多抗血清I g G 的纯化 8 1 血清 经2 0 0 0r m i n a 离心1 0 m i n 弃杂质，取l 份血清加入 2 倍体积的6 0m m o l L q 醋酸钠( p H4 o ) ，搅拌混匀并调 整p H 值至4 8 ，逐滴加入正辛酸( 每1 0m L 血清加入 0 7 5m L 正辛酸1 并不停的搅拌，待加完正辛酸后，室温 搅拌3 0m i n ，4 C 静置2h ，使其充分沉淀。4 ，1 20 0 0 r I I l i

17、 一离心3 0m i n ，弃沉淀，小心转移上清液至透析袋 中，用P B S 透析过夜。在透析后的上清中加入等体积 饱和硫酸铵溶液4 静置1h 后，4o C1 0 0 0 0r m i n _ I 离心3 0m i n 。弃上清液收集沉淀并溶于原始体积3 0 - 5 0 的P B S 中，透析过夜。透析后的液体即为所需鸡 抗I B D VI s G 。用紫外分光法测定其浓度。 1 2 2 封闭液的选择使用P B S T 配制的l B S A 、 I B S A 和5 脱脂奶粉l ：l 混合、5 B S A 、1 0 小牛 血清、5 脱脂奶粉、1 0 脱脂奶粉、5 B S A 和5 脱 脂奶粉l

18、 ：l 混合，分别作为封闭液，观察封闭效果。 1 2 3 鸡抗I B D V 多抗I g G 效价、鼠抗I B D V 单抗效 价的测定鸡抗I B D V 阳性血清纯化的I g G ，h l O h 1 0 0 倍比稀释。鼠抗I B D V 单抗1 ：2 0 0 l ：20 0 0 倍比 稀释。使用I B D V 疫苗( B u r 7 0 6 ) 作为阳性抗原，1 脱脂乳( P B S T 稀释) 为对照抗原，进行方阵滴定。测 定最适I B D V 多抗血清I g G 效价和I B D V 单抗效价。 1 2 4 组织样品的制备鸡法氏囊、脾脏、肺脏等组 织，按1 ：5 ( m V ) 加入灭

19、菌P B S 与石英砂一起研磨， 制成乳剂，反复冻融，离心沉淀取上清，一2 0 保存 备用。疫苗用p H 7 4 的P B Sl ：1 0 稀释备用。 1 2 5A C E L I S A 检测鸡传染性法氏囊病毒操作程 序包被：纯化的鸡抗I B D VI g G 用0 0 5t o o l p p H9 6 的碳酸缓冲液稀释，加入9 6 孔酶标板，每孔 1 0 0I x L ，置4 冰箱过夜；用P B S T ( 含O 0 5 T w e e n 一 2 0 ) 洗涤酶标板，每孔3 0 0 “L ，洗涤4 次；封闭：每孔 加入2 5 0 仙L 封闭液，3 7 恒温箱中放置2h ，洗涤4 次；加

20、被检样品：每孔加入被检样品1 0 0 此，同时 设立阳、阴性对照，3 7 孵育Ih ，洗涤4 次；加单 抗：按测定浓度稀释鼠抗I B D V 单克隆抗体，每孔加 入1 0 0 此，3 7 孵育1h ，洗涤4 次；加酶：加碱性 磷酸酶标记的羊抗鼠I g G ，每孔加入1 0 0 L ，3 7o C 孵 育1h ，洗涤4 次；加底物：每孔加入1 0 0 LP N P ， 显色反应6 0m i n ；终止反应：用2t o o l L qN a O H 终 止，每孔5 0 “L ，在4 0 5a m 读取吸光值。 1 2 6C u t - o m 阈值) 的计算测定3 0 份已知的阴性 样本的吸光值。

21、计算平均吸光值和标准差。平均吸光 值加3 个标准差之和即为判定阈值。 1 2 7A C E L I S A 特异性检测 使用建立的A C E L I S A 检测禽流感病毒、新城疫病毒、鸡传染性支气 管炎病毒、大肠杆菌、沙门氏菌等病原体，检测其特 异性。 1 2 8A C E L I S A 敏感性检测将B u r 7 0 6 疫苗，倍 比稀释l ：1 0 。l ：3 2 0 ；S H 9 5 超强毒人工感染法氏囊组 织1 ：5 制成匀浆悬液，倍比稀释至1 ：3 2 0 ；应用A C 万方数据 5 5 0上海交通大学学艰( 农业科学版) 第2 8 卷 E U S A 检测。 1 2 9 抗原捕

22、获E U s A 方法的应用用建立的 A C E L I S A 检测I B D V 疫苗、超强毒和疫苗毒人工感 染鸡的法氏囊、肺、脾等组织，以及疫苗接种鸡胚的 尿囊液、尿囊膜；购买的种毒和临床样品等。测得的 结果与【 _ P C R 检测的结果进行比较。 2 结果 2 1 封闭液的选择 使用几种溶液进行封闭试验，从结果分析，脱脂 奶粉封闭效果最好。5 B S A 和5 脱脂奶粉l ：l 混 合封闭稍好于5 脱脂奶粉，但差异不显著，后者已 满足试验要求。考虑到大规模使用的试验成本，选择 5 脱脂奶粉作为封闭液。详细见表l 。 裹1 封闭液的封闭效果 T a b l e11 h ee 6 e e

23、 t ao fd i f f e x 衄tU 蛐b l 堪e , r s 封闭条件 C o n d i t i o no f b l o e k i n g O D 值( 平行孑L ) R e s u l t sd 缁( d o u b l ew d l s ) 1 B S A 封闭0 6 3 9 0 5 8 7 l 璐A I B S A 和5 脱脂奶粉l ：l 混合封闭 o 1 5 2 ，o 1 4 8 l 璐A a n d 5 s k i n m 刨n i l k s ( 1 ：1 1 5 B S A 封闭 o 7 7 帅7 3 7 5 ；A 5 B S A 和5 脱脂奶粉l ：1 混合封

24、闭0 1 1 7 0 1 4 4 5 B S Aa n d5 s k i n e r e dn i U 西( 1 ：1 ) 5 J 猁蝴封闭0 1 5 0 0 1 4 9 5 虫h m 。dm i n e s 1 明湖旨奶粉封闭 o 12 7 0 2 1 7 l o s k i m l Y l 弛m i l k s 1 0 , I x 牛血清封闭0 2 4 9 0 2 6 8 1 0 f e t u sb o v i n es e r a 2 2 鸡抗I B D V 多抗I g G 效价、鼠抗I B D V 单抗效 价的测定 通过紫外光吸收法测定纯化的鸡抗I B D VI g G 溶 液的蛋白

25、含量为I J 3 7 38m g - m L 4 。经方阵滴定，选择相同 浓度下疫苗与对照吸光度比值最大的为最适浓度。鸡抗 I B D V 多抗血清l g G 最适浓度为1 2 5 汨当于4 2 9 5t t g m L ，I B D V 单抗最适浓度为1 2 0 0 。详细见表2 。 2 3C u t 埘值( 阈值) 的计算 经R T P C R 检测为阴性的样品3 0 份，用A C E U S A 检测，平均O D 值为0 1 8 82 ，标准差为0 0 2 2 8 。 根据统计学原理，约有9 5 4 3 的观测值在平均数左右 2 倍标准差白渤) 范围内。因此，C u t - o f f

26、值确定为平 均值加3 个标准差，即为0 2 6 0 。 2 4A C - E U S A 特异性检测 使用A C E L I S A 检测禽流感病毒、新城疫病毒、 鸡传支病毒等的结果见表3 ，从表中可知，A C E U S A 只能特异地检测I B D V 病毒。 2 5A C E u S A 敏感性检测 A C E L I S A 检测系列稀释的B u r 一7 0 6 疫苗和 S H 9 5 攻毒的法氏囊组织，结果见表4 。B u r - 7 0 6 疫苗 原液为l0 0 0 羽( 1 0 4C C I D 5 0 ) ，A C E L I S A 可以检测 出6 羽量的疫苗毒( 6 2

27、5C C I D p ，可以检测出1 ：1 6 0 稀释的阳性法氏囊组织。 2 6 抗原捕获E L I S A 方法的应用 2 6 1A C E L I S A 检测I B D V 疫苗、疫苗和I B D V 超 强毒人工感染鸡的组织检测结果与R T - P C R 检测 结果对照。2 0 个样品经A C E L I S A 检测，9 个阳性。 经R 1 - P C R 检测1 1 个阳性，结果见表5 。 2 6 2 检测购买的种毒及临床样品A C E L I S A 检 测种毒、尿囊液及l 临床样品，5 8 个样品中1 5 个阳 性。经R T - P C R 检测1 4 个阳性，结果见表6

28、。 2 6 3A C E U S A 方法与R 1 - P C R 的比较将A C E U S A 方法与R T P C R 方法检测的结果进行比较， 相符率为9 6 ( 7 5 7 8 ) ，详见表6 、表7 。 3 分析与讨论 A C E L I S A 是O I E 推荐检测I B D V 的方法之一。 表2 鸡抗I B D V 多抗I g G 效价和I B D V 单抗效价的滴定 T a b l e2C h e c k e r b o a r dt i t r a f i o n sp u r i f i e dc h i c k e na n f i - l B D VI g Ga

29、n d 咖a m i - I B D Vm o n o e l o n a la n t i b e d i e s 鼠抗I B D VM c A b m o u s c ：a n t i I B D VM c A b 疫苗( B u r 7 0 6 ) ，原液1 脱脂乳+ P B S T 为对照 ! ! ! ! ! ! ! 竺! ! ! 壁! ! 壁! 些! 婴竺! ! 堡! ! ! ! ! ! ! ! ! ! 堕! ! ! ! ! ! 竺1 1 ：2 0 01 ：5 0 01 ：1 0 0 01 ：2 0 0 0l ：2 0 0I ：5 0 0I ：1 0 0 0 1 ：2 0 0 0 万

30、方数据 第6 期 陈志飞，等：鸡传染性法氏囊病毒抗原捕获E L I S A 检测方法的建立及应用 5 5 1 裹3A C - E L I S A 特异性检测结果 T a b l e3T h er e s u l t s0 f , p e c m c i t y0 fA C - E L I S A 样品 o n 结果 郭建华;张冰 应用ELISA双抗体夹心法检测传染性法氏囊病免疫器官病毒抗原分布动态期刊论文-中国 畜禽传染病 1997(61) 4.汪培林 异源抗原在建立ELISA检测传染性法氏囊病毒抗体中的应用期刊论文-畜牧与兽医 1997(03) 5.张春红;伍惠卿;杜伟贤 应用间接酶联免疫吸

31、附试验检测鸡传染性法氏囊病病毒期刊论文-中国兽医科技 1996(12) 6.程宇;王笑梅;高玉龙 抗鸡IBDV Gt株单克隆抗体制备及抗原表位初步分析期刊论文-中国预防兽医学报 2006(06) 7.玛依拉阿不都克力木;钟旗;康吉克孜艾沙 月辛酸-硫酸铵法快速提纯鸡IgG期刊论文-新疆农业科学 1999(03) 8.U.S comments on draft import risk analysis for chicken meat G/SPS/N/AUS/198/Add.1期刊论文- http:/www.daff.gov.au/_data/assets/pdf_file/(0005/7238

32、3/USDA.pdf 2009 9.World Organisation for Animal Health.Infectious bursal digease期刊论文- http:/www.oie.int/eng/normes/mmanual/2008/pdf/2.03.12_IBD.pdf 2009 10.Mette Kusk;Susanne Kabell Differentiation of five strains of infectious bursal disease virus:Development of a strain-specific multiplex PCR期刊论文-Veterinary Microbiology 2005 11.Hassan M K;Saif Y M;Shawky S Commparison between antigen-capture ELISA and conventional methods used for titration of infectious bursal disease virus期刊论文-Avian Diseases 1996 12.贺荣莲;吴建敏;黄峻 鸡传染性法氏囊痛快速诊断方法的研究期刊论文-中国兽医杂志 1995(06) 本文链接：