Vero细胞传代过程中致瘤性的检测.pdf

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1、空坐堂生塑芏型鱼垂堂盘圭! ! l ! 笙! 旦篁! ! 鲞筮! 塑C h i nJM i c m b i o lh m n u n o l , M a y2 0 1 1 , V 0 1 3 1 , N o 5 V e r o 细胞传代过程中致瘤性的检测 李爱灵王红燕 张月兰赵玉秀马可张颖张晋梁宏阳赵硕王辉 【摘要】 目的为z 卜物制- 研牛产及研究用V e t o 细胞体系传代过程中的遗传安 牟= 性评价提供 实验数据。方法对V e r o 细胞进行传代与冻存，并对不同代次V e t o 细胞进行体外与体内致瘤性检 测，同时对不同代次V e r o 细胞的蛋白质表达进行差异性分析。结果V e

2、 t o 细胞传代至2 7 0 代并建立 了1 4 个细胞冻存库；不同代次V e r o 细胞体外与体内致瘤性榆测结果均为阴性；2 0 0 代以上的v e r 0 细 胞蛋白质表达水平有所变化。结论V e r o 细胞传代过程中虽然体外与体内致瘤性检测结果为阴性， 但蛋白质组学分析有差异性蛋白表达，这为V e r o 细胞传代过程巾的遗传安全性评价提供了实验 参考。 【关键词】 疫前细胞基质；V e r o 细胞；传代安全性；致瘤性榆测；蛋白质组学分析 E x p e r i m e n t a l i n v e s t i g a t i o no n t u m o r i g e n

3、i c i t yo f V e r oc e l l i n t h ep r o c e s so f p a s s a g eL A i l i n g ，W A N G H o n g y a n ，Z H A N Gr u e l a n ，Z H A 0Y u x i u ，M A ，Z H A N GY i n g ，Z H A N GJ i n L I A N GH o n g y a n g Z H A O S h u o ，删_ _ v GH u in eF o u r t hV a c c i n eL a b o r a t o r y B e i f i n gT

4、i a n t a nB i o l o g i c a lP r o d u c t sC o L t d B e i f i n g 1 0 0 0 2 4 ，C h i m t C o r r e s p o n d i n ga l l t h o r ：W A N GH u i E n t a i l ：w h 6 2 4 7 s o h uc o m 【A b s t r a c t 】0 b j e c t i v e T op r o d u c ea ne x p e r i m e n t a li n f o r m a t i o nf o rt h es a f e

5、t ya s s e s s m e n to fV e r o c e l l sd u r i n gs u b c u l t u r eM e t h o d s P a s s a g ea n df r e e z eo nV e t oc e l l s a n dV e r oc e l l si nd i “；r e n tp a s s a g i v i t r oa n di n 撕口t u m o r i g e n i c i t y w e mt e s t e dT h ep r o t e i ne x p r e s s i o no fd i f f e

6、r e n tV e t oe e l j p a s s a g e sw a sa n a l y z e d R e s u l t sV e t oc e l l sp a s s a g e dt op 2 7 0a n d1 4c e l lb a n k sw e r ed e v e l o p e da n ds t o r e df o rf u t u r ee v a l u a t i o nI nv i t r oa n di nv i v ot u m o r i g e n i c i t yt e s tr e s u l t so fV e t oc e l

7、 l si nd i f f e r e n tp a s s a g e sw e r en e g a t i v eC o n c l u s i o n A l t h o u g ht h et u m o r i g e n i c i t yt e s tr e s u h si nv i t r oa n di nv i v op r o c e s sw e r en e g a t i v e t h 8p r o t e i ne x p r e s s i o no fn o r et h a np 2 0 0V e r oc e l l sw e r ec h a n

8、 g e d w h i c hp r o d u c e dt h ee x p e r i m e n t a lr e f e r e u c ef o rt h es a f e t y e v a l u a t i o no ft h ep r o c e s sd u r i n gt h eV e r oc e l Ip a s s a g e 【K e yw o r d s 】 V a c c i n ec e l ls u b s t r a t e ；V e r oc e l l t e o m i c sa n a l y s i s V e r o 细胞是一种非洲绿猴

9、肾的传代细胞系，作 为疫苗生产用细胞基质已被，“泛用于病毒性疫苗的 研究开发和生产巾”“。而生物制品生产用细胞基 质的安全性与生物制品终产品的安全性密切相关， 因此，建立良好的生产用细胞体系是提高生物制品 安全性的重要环节“。然而，应用V e r o 细胞系生 产疫苗可能存在的风险早已被提出” ，其在传代过 程中的动物致瘤性问题已有相关文献报道”。1 “。因 此，有必要对V e r o 细胞在传代过程中致病性的检测 作进一步的分析”。 D O I ：1 03 7 6 0 c m aJi s s n0 2 5 4 j 1 0 12 0 1 10 50 1 7 基金项目：国家科技支撑计划( 2 0

10、 0 8 B A l 5 4 8 0 4 4 ) 2 ) 作者单位：1 0 0 0 2 4 北京天坛生物制品股份有限公司疫苗四室( 李 爱灵，千红燕，张月兰，马呵，张颖，张晋，粱宏阳，赵硕) ，质量保证部 ( 赵玉秀，王辉) 通信作者：王辉，E m a i l ：w h 6 2 4 7 s o h uC O n l ，电话：0 1 0 4 5 5 7 6 2 9 1 1 2 3 2 6 免疫检测 本研究分别应用体外法和体内法对高传代V e r o 细胞进行了致瘤性检测，同时应用双向电泳结合质 谱分析的方法对不同代次的V e r o 细胞进行了蛋白 表达差异性分析”1 ，为生物制品建立良好的生产

11、及 研究用V e r o 细胞体系，明确生物制品终产品组分， 去除产品宿主细胞蛋白残留，改进企业生产工艺，确 定细胞库使用代次提供实验依据。 材料和方法 细胞株和实验动物：1 2 9 代V e t o 细胞由北京天 坛生物制品股份有限公司疫苗四室提供。1 8g N u n u 裸鼠及1 日龄B A L B c 裸鼠乳鼠由天坛生物 制品股份有限公司实验动物室提供。 试剂、溶液及仪器：V e r o 细胞生长液、0 2 5 胰 蛋白酶由天坛生物制品股份有限公司配液室提供； 二甲基亚砜购自北京化学试剂公司；低溶点琼脂糖 购自U S B 公司；C H A P S 、D T F 、D N a s em

12、i x 、蛋白质抑 万方数据 叫# 啦l I 辑目埘t 抽 2 0 I 】4 1 上“m3 I 艟5 I M i t n ，| b iq I t m n m I 。当y2 4 ) I 】Vc ，j 3 l j 5 剐剂、碘乙酰胺、球求和紫外分光光度计蚴 1 m w s h a mB i ( 4 e l e m ：e s ：碳酸氧铵购r | J 匕求化学试剂公d ： 阿酮购1 3J 匕京北化精细化学晶钉限责任公司O0 5 i n o l l 的r r i s I I C I 溶液( r n s60 5 5g 1 m o l IH C I 酬p l I 长73 ) ；裂解液( 球索7m o l I

13、 硫棘2 t n t d t ：I l A P S4 】川l 6 5 n n o l I B i o I y t 02 0 h 澳衔雌00 0 I ) ；2 5 0 牛化培养箱购r 1 哈尔滨I H 采I + JJ K 疗阪器J ；S i g m a2 1 6 K 高速台止离 ，L J L ；倒m ! 【 微镜购自I f 夺魁林巴斯公一d 细胞传代与冻存：“天坛m 物制一铺峻份打限公 一嫂* 心空h ”1 2 9 t ：f l l l 胞( 2 0 0 7 0 1 1 7 批1 n 代) 精进 i P l l l 胞堑抛，晰细胞K 戚豉晰单膳后进 r f 代约衄7 凡传f ，I ：6 分种分钟

14、细胞数| t 1 0 “ 一2x1 0 。个2 5 T 1 二细胞瓶细胞传代过襁r I ，从 V p r o 细胞1 4 0 代J 1 ：始，每I O 代球存1 次，冻仔前进 f 培养堆无带榆A 、培莽苍点娘体榆 细胞彤奄观 察及细胞外跺州r 椅删( 1 0 L 吸舯 法) 体外法致瘤性榱测：软琼脂皿落形成毕酞验 ( 软琼脂兜降) 4 将12 r b 低熔_ 琼脂特+ o2 俯 V e r o 细胞t l ：长液“1 ：I 的怵秘比 M 合制蔷06 的 底层琼脂6 孔板巾每个孔I 4m l 濉窜凝固取t 数 蝴l e r o 细胞，腴瞬淌化后吹敖成啦个细胞悬澈，细 胞汁数井 l 爿鸺自 f 咆

15、浓度为1 00 0 0 个m l ，将06 低 熔点琼脂特IJ2x 细j 1 6 I 生长液以1 ln q 体g ：比濉 台，栅箭03 的rJ 盖琼脂。f 4 孔加1n dI ：腥琼晰 和1 0 0p + l 竹细胞怂液( 约1 0 0 0 个4 L ) ，湿匀率温 凝同霞于3 7 t 5 C O ，的绑胞培养箱r lz 培养3 周观察细胞集蒲形成率。将V 筇1 4 2 代、t 9 2 f 、2 4 2 代、2 5 2 代细胞片j 戟琼脂集落形成方法检测 打无单细胞集 客的形成同时址2 B S - 3 5 代作为 忡1 【_ f 心，H e p 2 - 1 9 5 代作为m 性对照 体内法致瘤

16、性检查：1 8g 爿 乱4 】l I 龄锞鼠乳 丽敢确性试验：按照中华人民兆和同药典( 2 0 0 5 年版) 细胞致螂性检查的方法，用B A L B c 棵鼠、 N u u 裸鼠对V e r o 细胞1 6 0 代、1 8 0 代、1 9 0 代、2 0 0 代、2 I O 代细胞的敛痼性进行搞洲井对注射部化进 L + t N 病理切 榆荫H 。p 2 1 9 5 代细胞做阳f l ! 埘 j l c ，2 B S 一3 2 代细胞做阴性对照同时应厢B A B c 1 I I 龄乳鼠谍醴对V e t o 细胞的1 4 3 代、1 9 3 代、2 3 5 代、2 5 3 代进f f 致谢性检测

17、并对注射部位暖裸旺并 脏器作组织病理切片检查。f l o p 2 1 9 5 代细胞做m 性对照2 B S 一3 2 代细胞做阴性, q N 蛋白表达差异性分析：荧光篪并烈向凝脞电泳 ( D I G E ) 分析0 肚质辅助激光解折E r I I f 质l * ( M I + D I I O F M S ) 糕定”V e t o 细胞钔1 4 0 代， 2 ( 1 0 代、2 5 0 代2 6 0 代卸l 胞K 成敛褂单层后02 5 胰蛋一麟消化细胞，00 5n dr r i s H C I 收雄细胞r 15m lE l + p e n d o i f 管中，9 0 0r m i n 离心1

18、0m i n ， 00 5r i l l1 r l s - I I C I 洗涤3 跌后收集细胞，每管加入 1 0 0I x l 细胞裂解渡睾4 解细胞时8 0 0r m i 离- O , I f ( 壤裂解蚩I 。I J F 将蚩r I 转夸5m l 离心符I h 5f i _ f 傩秘 的一2 0 t 麒冷阿酮反复优涟V e t o 细胞裂解蚩F l 3 趺，其t | 第1 次帆淀i = 上傲，筇2 次。I 第3 敞沉淀M 隔 4h 获褂小时代次的蛋r 1 样曲将样品送外榆做 I ) G E 分忻J f ：将V 1 4 0 f t l j ：2 6 0 代州蛋I I 篪”点 n ? 进步的

19、M 】I ) I - T O I s 质l 件罄定分析 结果 1 V e r o 细胞的传代与冻存：V e r o 细胞f 代举 2 7 0 代6 i f ；+ 节2 5 0 代府倒什艟傲镜F 啦察细胞肜 志1 ，蚺4 * 能J J 订所变化球仃细胞的尢苘试蛤盘 睬体椅 、外源r 扮测结肥均为I I J I P I ! ( 1 到I ) T 围Iv e 目胞传代月片( x 1 0 0 ) F i 9 1 P h o l o so fd i f f e M 1V e mc e l lp 目g Cx 1 0 0 ) 2 体外法致瘤性检测：轼琼脂集落形成率试验 ( 软琼脂克隆) 挂示H e p 2

20、细胞有集落形成站余样 品均无集落形成( 图2 ) 3 体内法致瘤性检查：1 8g 操鼠致恼性试输结 果硅w i I t E 对照( 2 B S - 3 2 代) 组术弛结4 S R 【r l i x C J ( ! 组( H ( - p 2 - 1 9 5 代细l i t + ) 柯肉眼l | T 址站竹 r e r o 细胞 各代状! I r i S l 眼观察均束址结I s 结果均为j 性。将 样本做，L 理切片，也未见 性结果牛理七J J ”结粜 她图3 4 体内法致瘤性检查：ll I 龄裸鼠乳鼠敛摘陆 泼骑耋_ i 粜到笫1 6 天时H e l l 2 - 1 9 5 代纽订可见删其

21、他 | 1 佳脱察3 十J j 衍均术见肉限c - J 见摘( 4 ) 将 万方数据 止t 煎生扭生塑玺生堂韭盘垫业生上丝韭盟监堑删业B 坐型型上! 型且旦生垫生J 垫土L 塑 样水做生理切J v 伸，细胞释代次n 锞鼠乳毗巾的 敛瘤性切J 也均为性。生理切片结果如嘲5 所 i 。 目2 较琼l 目集落形或试验月片( x I o o ) F L g2S o f la g a r l o n y f o m a t i o n 埘( x 1 0 0 围4 11 3 龄阳性对照组裸鼠乳鼠出癯月片 F i g4 P h o t oo fp o s i t i v ec o n t r O l # m

22、 u p J 迷结果发明，V e m 钏胞 4 0 2 5 0f 敢蜥忡 榆卉nB A L B t 成年磔鼠、N u l 磔鼠硬B A I l t 乳 鼠中均未检查出癌蜘】胞2 B S 璺胞检查结粜为引讹 H e p 2 细胞均为阳性 5 不同代次V e r o 细胞蛋白表达差异性分析结 果：椅洲结粜! B 小，n 比较磬数T E S T 一 m b o l = I 1 I AP c p l i d ) 1p m l y l e l S 小a n si s o m e r a s eA 具f 健进蛋r I 折稗的作什j “ 提示可能与蛋t l 质的纽建o 功能改变柑关这衅筹 扦监门的县棒作1

23、jJ 迁订待下忤进一步的分4 ；l ： 万方数据 坐坐邀生堑堂塑鱼瘗堂盘壶! ! 1 1 生! 旦笙j ! 鲞苤! 塑C h i nJM i c r o b i o l l m m u n o , M a2 0 1 1 , V 0 1 3 1N o 5 表2 V e r o 2 6 0 代细胞较V e r o 1 4 0 代细胞表达量上升的1 2 个蛋白点质谱( M S ) 鉴定结果 T a b l e2 M Sr e s u l t so f1 2i n c r e a s e de x p r e s s i o np r o t e i ns p o t so fV e r o - 2

24、6 0c e l l sc o m p a r e dw i t hV e r u 1 4 0c e s 蛋白点弩孝 数据库序号 蛋白质名称 单嚣鲁 等电点 晋孽辛 蛋白质描述 z 一。m s 慧兰篓羔测篇篇嘉了i 藏燕熏藏雾乎燕蓁 草酰己酶+ L 符氩酸 I P l 0 0 0 1 7 3 3 4 _ I d = 9 6 0 6 ，C e n eS y m b o l ：P H BP r o h i b i t i n H # 女2 98 4 29 3 8 l I P l 0 0 2 1 6 3 。8 a T m o “_ n I 咖d = 9 6 0 眦6 c C h m 姗n e e _

25、 l S 胛y n d 3 0 l = l V 电D A 压C 依I V 赖o l r 性a g 阴e - d 离e p 于e n 通d e 道n t 3 08 6 761 9 1 抗体1 T “一I d = 9 6 0 6 ，G e n e S y m b o l = H S P D Ie D N AP L J 5 1 0 4 6 5 3 _ 7 1 P 1 0 0 9 1 7 5 7 5 h i g h bs i m i l a rt o6 0k D ah e a t “kp m t e i n ，m i t o c h o n d 5 52 2 0I1 6 5 粒体中热澈蛋A1 6 3

26、I D l 0 0 7 9 7 5 5 6 T 联a 1 蛋_ l 白d = A 2 9 6 0 6 c 。”州d2 2 M 帅”础 2 4 5 6 17 弹 T a x l d = 9 6 0 6 ，G e n e S y m b o l ：E T F AE I t t r as f e r 5 I P l o n 0 1 0 8 1 0 月a v o 州d 月s u b u n i t d 曲8 ，m i t o c h o a d r a 电于传递黄素 3 55 9 97 0 6 蛋白的a 亚基 82 _ 1I P l 0 0 2 2 0 3 2 7 9 2 jI P I 加2 2 叫8

27、 7 “2 9 1 6 0 蚋咐6 , G 自e n e 自5 y m 吧慧鳃“n _ b 舻c r 嘶1 4 985t 0 s k e l e t a l l 细胞角蛋白1 ，细胞骨架 唧” 0 0 抑制D N A 的台成+ 调控细胞增殖 1 0 0 形成卟从线粒体到膜外的一个通道 1 0 0 分子伴侣 0 0 功能不详 一种特定的脱每酶电子受体黄素蛋白+ 包括血种酰基 9 99 8 2 辅酶 脱氢酶、戊：辅酶A 和肌氨酸脱氢酶。它通过 E I F 泛醌氧化还原酶将电子转移绐士线粒体呼吸链 ：锦黼黧勰减；基篙 I d = 9 6 0 6 ，( ；e r i e S ) m b o l = A

28、 T P 5 Hl s o f o m ln fA T P 蒜i 山“叱咖h 0 商乩T P A 成靴基d 舁 ”5 拍57 6 9 9 瑚 线粒体膜r 椰合成酶 。t ，- 一w s 。裂怒盏盖警端瓣嚣“e m 。s ， 存在于线特体内的蛋白质，可促进蛋白质的正确折叠 9 0 “ ：；：防止错误折叠和应激条件下线粒体基质中多肚 T “I d = 9 6 0 6 ，G e n e S y m b o l = R A S S F 8f s o G m l2 o f 。6 ”5 耋篙蒜妒一“”8 相越绵码。”1 5 1 ”8 ”信 转 ”L 一5 ”9 寇：锉写糍；嬲一一”4 “ 。獭触撇懒恍 表

29、3 V e r o 2 6 0 代细胞较V e t o - 1 4 0 代细胞表达量下降的1 3 个蛋白点质谱( M S ) 鉴定结果 T a b l e3 M Sr e s u l t so f 1 3d e c 删e x p r e s s i o np r o t e i ns p o t so fV e r o - 2 6 0c e i l sc o m p a r e dw i t hV e r o 1 4 0c e l l 8 D 序I G 号E 数据库序号蛋白质名称 撇 等电点 钎 蛋白质描述 一u w 端曹黼一“面r i i 21 4 同上 3 l j I P 1 9 5 8

30、5 怒i ：。：I 竺 G 阿e n 肚e _ 黼S y m b o l 顺= ：茹嚣A i d “”“”1 8 2 2 9 0 76 8 】0 0 阿肚脯自酰顺& * 椅鲆促进口自扦叠 。 - ，- n “m s s 兰慧= 篇蒜；尝蒜翟；嚣i 。d y 。州加” 1 82 2 9 0，n- o o s ，一- P 1 0 ( m 2 5 2 5 z ：兰麓器蛊嚣嚣絮“8 “。 T q x _ I d = 9 6 0 6 ，G e n e S y a t b o l = A C T Be D N AF L J 5 2 8 4 2 63 _ 41 P I C 0 8 9 4 3 6 5 h i

31、 g h l ys i m i l a r t oA e t i n ，e y i o p l 酬e1 肌动蛋白B ，细胞 基质 催化二硫键的重新折叠。T A P 复合物亚基，也被称为 5 7 1 4 5 9 5 ”燃黜籍毋”稚桃鼽； 3 95 4 275 41 0 0 肌动蛋自家旌 7 3 j 1 0 0 ：。2 篙蠢淼鑫茹；“8 。9 l 5 4 31 0 0 a a 镕日9 # n H 蝴自部疏m 自性 9 3 I P l 0 0 7 8 9 1 3 4 3 T 、“曲_ 。t 。d p h = m 9 e 6 0 d 6 e i 州G m e n g e e S y e m 3 b o

32、 磷l = 酸G 甘A 油P D 醛H 脱G 氧l v c 酶e r a l 8 。“7 “ 2 8 0 2 4 16 硝帅5 7 9 参与碳水化台物降解的一种脱氢酶 。 J - 7 _ 7 。黜i 篙盎e f a c l 0 S y m r 2 延b o l = ”- e D 酐N A 篇飘嘞。B s ”2 ”6 - 目饿 1I 同上 1 2 2 _ 5I P l 0 0 6 4 6 5 8 0 T a x = 9 6 0 6 ，C e e S y m b o l = C Y B 5 A5k D np r o p e l 口 万方数据 一 r 堡邀生塑生塑鱼蕉芏型直垫! ! 至! 坦篁! !

33、 鲞蔓! 塑! ! 坐丛! ! 翌! ! ! ! ! 坐坐! 些l ，丛业! ! ! ! ：y 世! l ：塑生! 参考文献 1 M o n t a g n o nB J ，V i n c e n t - F a l q u e tJ C ，S a l u z z oJ FE x p e r i e n c ew i t h v e mc e l l sa tP t e u rM g r i e u xC o n n a u g h tD e vB i o lS t a n d 1 9 9 9 9 8 ：1 3 7 1 4 0 ；d i s c u s s i o n1 6 7 2 G o v

34、 o r k o v aE A ，M u r f iG ，M e i g n i e rB ，e t a lA f r i c a ng r e e n m o n k e y k i d n e y ( V e r o ) c e l l sp r o v i d ea l la l t e r n a t i v eh o s tc e l ls y s t e mf o ri n f l u e Aa n d Bv i r u s e sJV i r o l ，1 9 9 6 ，7 0 ( 8 ) ：5 5 1 9 - 5 5 2 4 3 C h o i Y ，A h nC J ，S e

35、 o n g K M ，e t a lI n a c t i v a t e dH a n t 船nv i e sv a c c i n ed e r i v e df r o m s u s p e n s i o n e u h u mo fV e r oc e i l s V a c e i n e 2 0 0 3 ，2 1 ( 1 7 1 8 ) ：1 8 6 7 - 1 8 7 3 4 丁志芬，开慧颖，庞成华，等转瓶培养非洲猴肾传代细胞生 产纯化流行性乙型脑炎疫苗的研究中华医学杂志，1 9 9 8 + 7 8 ( 4 ) 2 6 1 - 2 6 2 5 P e t r f o c i

36、 a n iJC e l ls u b s t r a t e s ： d i s c u s s i o n ? D e vB i o IfB a s e 7 3 6 张德礼研制安全病毒疫苗 1 1 4 2 “ w h e r ed ow es t a n da f t e r5 0y e a r so f 2 0 0 6 1 2 3 ：1 1 - 2 1 ：d i s c u s s i o n5 5 中同高校科技与产业化2 0 0 2 7 H o r a u dF A b s e n c eo fv i r a ls e q u e n c e si nt h eW H O V e t

37、oC e l l B a n kAc o l l a b o r a f i v es t u d yD e vB i a lS t a n d 1 9 9 2 7 6 ：4 3 - 4 6 8 M a n o h a rM ，O r r l s o nB ，P e d e nK ，e ta lA s s e s s i n gt h et u m o r i g e n i c p h e n o t y p eo f V E R Oc e l l si na d u l ta n dn e w b o r nn u d em i c eB i o l o g i c a l s ，2 0

38、0 8 ，3 6 ( 1 ) ：6 5 - 7 2 9 z h 肌gD L ，J iL ，L iL J ，e ta lS y s t e m a t i c a l l ye x p e r i m e n t a li n v e s t i - g n t i o no nc a r c i n o g e n e s i s o rt u m o r i g e n i c i t yo fV E R Oc e l ll i n e so f d i f f e r e n tk a r y o t y p e si nn u d em i c ei nv i v ou s e df o

39、 rv i r a lv a c c i n e m 衄u f o e t u r eY iC h u a nX u eB a o ，2 0 0 4 ，3 1 ( 7 ) ：6 4 7 - 6 6 0 1 0 张德礼，李六金，夏耕田，等动物细胞系的染色体组型与遗 传变异率分析遗传学报，2 0 0 1 ，2 8 ( 4 ) ：3 2 7 - 3 4 4 1 1 盂澈芳，李修兰，冯建平，等我国生物制品生产用细胞外源 因子污染情况检测中国生物制品学杂志，2 0 0 6 ，1 9 ( 6 ) ： 6 2 7 - 6 2 9 ，6 3 2 1 2 K n e z e v i eI ，S t a c e

40、yG ，P e t f i c c i a n iJ ，e ta lW H OS t u d yG r o u po R c e l ls u b s t r a t e sf o rp r o d u c t i o no fb i o l o g i c a l s ，G e n e v a ，S w i t z e r l a n d ， 1 1 - 1 2J u n e2 0 0 7B i o l o g i c a l s ，2 0 0 8 ，3 6 ( 3 ) ：2 0 3 - 2 1 1 1 3 G r a n d iG 基因组学、蛋白质组学与疫苗1 版北京：化学工 业出版社，2

41、 0 0 6 ：7 9 1 3 2 1 4 李六金，李秦，施新猷四种传代细胞株软琼脂抛锚能力观 察第四军医大学学报，2 0 0 0 ，2 1 ( 6 ) ：7 3 6 - 7 3 7 1 5 刘小林蛋白质组学及其研究进展安徽农业科学，2 0 0 7 ， 3 5 ( 3 1 ) ：9 8 1 0 - 9 8 1 2 9 8 1 8 1 6 廖翔，应天翼，王恒操，等考马斯亮蓝染色双向电泳凝胶胶 内酶切方法的改进生物技术通讯，2 0 0 3 ，1 4 ( 6 ) ：5 0 9 - 5 1 l 1 7 R i c h a r dJS i m p s o n P m t e i ma n dP m t

42、e o m i c s ：AL a b o r a t o r yM a n - 4 6 l C o l dS p r i n gH a r b o r ：C o l dS p r i n gH a r b o rL a b o r a t o r yP r e s s 特怀曼蛋白质组学原理北京：化学工业出版社 1 9 j 郭尧君蛋白质电泳实验技术2 版北京：科学出版社， 2 0 0 5 2 0 阮松林，童建新，赵杭节双向电泳技术研究进展杭州农业 科技，2 0 0 6 ，( 5 ) ：2 - 5 2 1 W i l k i n sM R ，P a s q u a l iC ，A p p e l

43、R D ，e ta lF r o mp w t e i n st op m t e o l n e S ：1 8 r 9 8s c a l ep m t e i ni d e n t i f c a t i o nb yt w o d i m e n s i o n a le l e c t r o p h o r e s i sa n da m i n oa c i d 肌a l y s i sB i o t e c h n o l o g y ( NY ) ，1 9 9 6 ， 1 4 ( 1 ) ：6 1 - 6 5 2 2 C h a n g w w ，H u a n gL ，S h

44、e nM ，e t a l P a t t e m so fp r o t e i ns y m h e s i sa dt o l e r a n c eo fa n o x i ai nr o o tt i p so fm a i z es e e d l i n g sa c c l i m a - t e dt oal o w o x y g e ne n v i r o n m e n t ，a n di d e n t i f i c a t i o no fp r o t e i n sb y s p e c t r o m e t r yP l a n tP h y s i o

45、 l ，2 0 0 0 ，1 2 2 ( 2 ) ：2 9 5 - 3 1 8 2 3 雷殿良W H O 召开细胞基质安全问题工作会议中国生物制 品学杂志，2 0 0 3 1 6 ( 2 ) ：1 2 6 - 1 2 7 2 4 S h e e t sR ，P e t r i c e i a n iJ V a c c i n ec e l ls u b s t r a t e s2 0 0 4E x p e r tR e v V a c c i n e s ，2 0 0 4 ，3 ( 6 ) ：6 3 3 - 6 3 8 2 5 W o l fJ J ，W a n gL ，W a n gFA

46、p p l i c a t i o no f P C R t e c h n o l o g y i nv a c c i n ep r o d u c td e v e l o p m e n t E x p e r tR e vV a c c i n e s ，2 0 0 7 ，6 ( 4 ) ： 5 4 7 - 5 5 8 2 6 W h i t i n gG C ，R i j p k e m as ，A d a m s T ，e t a lC h a r a e t e r i s a t i o no fa d s o r b o da n t h r a xv a c c i n

47、eb yt w o d i m e n s i o n a lg e le l e e t r o p h o r e s i s V a c c i n e ，2 0 0 4 ，2 2 ( 3 l - 3 2 ) ：4 2 4 5 - 4 2 5 l 2 7 B a l g n c e m0 ，S t U b i g e rG ，A l l m a i e rG ，e ta l I s o l a t i o no fe s t e r i f i e d f a t t ya c i d sb o u n dt o s e l 1 l ma l b u m i np u r i f i e

48、 df r o mh u m a np l a s m a 肌dc h a r a c t e r i s e d b y M A L D Im a s s s p e c t l l o m e t r y B i o l o g i c a l s 2 0 0 7 ，3 5 ( 1 ) ：4 3 - 4 9 2 8 S h i nJ ，W o o dD ，R o b e r t s o nJ ，e ta lW H Oi n f o 皿a lc o n s u l t a t i o n o n t h ea p p l i c a t i o no f m o l e c u l a r

49、m e t h o d s t o t h eq u a l i t s a f e t ya n de f f i c a c yo fv a c c i n e s ，G e n e v a ，S w i t z e r l a n d ，7 4A p n l2 0 0 5 B i a l o g i e a l s ，2 0 0 7 ，3 5 ( 1 ) ：6 3 - 7 1 2 9 L i nJ F ，X uJ ，T i a r aH Y ，e ta l I d e n t i f i c a t i o no fc a n d i d a t ep r o s t a t e c a l e e rb i o m a r k e r si np r o s t a t en e e d l eb i o p s ys p e c i m e n su s i n gp r o - t e o m i ca n a l y s i sI n tJC a n c e r ，2 0 0 7 ，1 2 1