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1、基金项目 江苏省科委“九五”攻关课题基金资助项目 (No.BJ98100) 第 21卷第 2期 2001年 3月 南 京 医 科 大 学 学 报 ACT A UNIV ERSITAT IS M EDICINALIS NAN JING 人外周血单核细胞体外诱导树突状细胞及鉴定 谢芳艺 ,姚,王胜军 ,彭光勇 ,季晓辉 (南京医科大学微生物免疫学教研室 ,江苏 南京 210029) 摘要 目的: 建立从人外周血单核细胞体外诱导培养树突状细胞 (dendritic cell, DC)的方法。方法: 分离人外周血单个核细胞 , 以细胞因子粒细胞 - 巨噬细胞集落刺激因子 ( GM-CSF)、白细胞介素
2、 - 4( IL-4)、肿瘤坏死因子 ( TNF- )诱导培养获得 DC,电镜及共 聚焦显微镜观察其形态 ,流式细胞术检测细胞表面抗原 ,体外同种混合淋巴细胞反应检测 DC刺激 T细胞的增殖活性。 结果: 从正 常外周血分离得到的单核细胞 ,体外经重组人GM-CSF、IL- 4、TN F-的共同诱导培养 ,得到大量成熟DC。形态学观察可见典型DC 特征 ;荧光激活细胞分离器 ( FACS)检测表明 ,诱导的 DC高表达 HLA- DR( 96 % )、 CD83(94. 2 % )、 CDla( 94. 2 % )分子 ,同时也高表 达 CD40( 97. 7% )、 CD80(98. 2 %
3、 )分子。同种混合淋巴细胞反应显示 ,诱导的 DC具有很强的激发同种 T细胞增殖的能力。结论: 人 外周血单核细胞体外经细胞因子贯序诱导培养 ,可以生成大量功能成熟的 DC,为进一步开展 DC的基础研究和临床应用提供了可 能。 关键词 树突状细胞 ;单核细胞;细胞因子 ;混合淋巴细胞反应 中图分类号 R329. 2+4 文献标识码 A 文章编号 1007- 4368( 2001) 02- 0111- 04 Inducing of Dendritic Cells from Human Peripheral Blood Monocytes and Its Identification XIE Fa
4、ng-yi, YAO Kun, W ANG Sheng-jun, PENG Guang-yong, JI Xiao-hui (Department of Microbiology and Immunology, Nanjing Medical University, Jiangsu Nanjing 210029,China) Abstract Objective: To estabilish the method of inducing dendritic cell from human peripheral blood minocytes in vitro. Methods: Monocyt
5、es were isolated from normal human peripheral blood mononuclear cells ( PBMCs) and cultured with the cytokines ( GM-CSF, IL-4, TNF- ) . The morphology was observed by elec- tron microscope and confocal analysis. The surface antigen of the induced cells were analysed by fluorescence- activated cell s
6、orting( FACS). T cell proliferating activity was determined by allo-M LR ( mixed lymphocyte re- action) in vitro. Results : Large amount of mature DCs could be obtained from monocytes by culture in presence of GM-CSF、 IL-4 and TNF- . DCs expressed high level of HLA-DR, CD83, CD1a, CD40, CD80, and we
7、re po- tent to stimulate the proliferation of allo-T cells. Conclusion : Large amount of mature DCs could be generated in vitro by culture of human peripheral blood monocytes with the cytokines. Key words dendritic cell; monocyte; cytokines; mixed lymphocyte reaction Acta Nanjing Med Univ, 2001, 21(
8、 2): 111-114 树突状细胞 ( DC)是目前已知的机体内功能最强 的“专职性”抗原提呈细胞 ( antigen presenting cells , APCs) ,是唯一能在体内外直接激活初始 T细胞的 APCs。 DC在组织中含量甚微 ,在血液中仅占单个核 细胞总数的 0. 5 %1. 0 % ,难以分离、纯化 ,且 DC呈 高度分化状 ,体外不易长期培养 ,更难建系 ,其来源的 困难成为深入研究、应用需求的障碍。由于 DC的前体 细胞来源不同 ,采用的细胞因子组合也不尽相同 1。本 研究于 1999 2000年从正常人外周血获取单核细胞 , 经体外细胞因子粒细胞 - 巨噬细胞集落
9、刺激因子 ( GM- CSF) 联合白细胞 介素 -4( IL-4)、肿 瘤坏死因 子 - ( TNF- )可生成大量成熟 DC,并通过其形态、表型及 刺激活性等来鉴定。 1 材料和方法 1. 1 主要试剂 GM-CSF由华北制药厂提供;重组人 IL-4 、 TNF- 购自 Promega公司;淋巴细胞分离液购自中国医学 科学院血液学研究所;丝裂霉素 C购自 Kyowa Hakko 111 Kogyo 公司;鼠抗人 HLA-A、 B 、 C, HLA-DR, CD14, CDla单克隆抗体购自华美公司; CD80购自 Southern Biotechnology Associates公司; C
10、D83购自 Ancell公 司; CD40 、 FITC标 记 兔抗 鼠 IgG 荧 光 二抗 购 自 PharMingen公司。 RPMI 1640(含 10 % 胎牛血清 )购 自 Gibco公司 ,含有 100 U /ml青霉素、链霉素 , 40 U / ml庆大霉素。 1. 2 树突状细胞体外培养 新鲜分离的健康成人白细胞悬液 ,经淋巴细胞分 离液分离单个核细胞 ,用无钙镁 Hank液 ( pH 7. 2)洗 细胞 3次 ,去除血小板 ,用完全培养基悬浮细胞 ,加入 24孔板 ,每孔 3 10 6 细胞 , 37 5 %CO2孵箱培养 2 h后 ,吸弃培养上清 ,用培养基轻轻洗培养板以
11、去除非 贴壁细胞 ,即获得贴壁的单核细胞 ,每孔再加入含有 GM-CSF 200 ng /ml, IL-4 500 U /ml的完全培养基 1 ml。 培养第 7天 ,每孔加入 TNF- ,终浓度为 200 U / ml,于培养第 10天收集悬浮细胞。 1. 3 电镜观察 DC悬液用 PBS洗 2次 ,离心 1 000 r / min,每次 5 min, 4 %戊二醛固定后行扫描电镜观察和摄片。 另取 DC悬液离心 3 000 r / min, 30 min使细胞沉淀 , 4 % 戊 二醛固定后行透射电镜观察和摄片。 1. 4 DC表面抗原检测 DC用 PBS调整细胞浓度 1 10 6 /ml
12、,加入 Ep- pendorf 管 , 100 l /管 ,再加入 PBS稀释的一抗 100 l,置 4 标记过夜后 , PBS洗细胞 2次 ,加入 FITC标 记兔抗鼠 IgG荧光二抗 , 100 l / 管 , 37 暗处标记 30 min, PBS洗 3次 ,细胞悬于含 10l % 多聚甲醛的 PBS 中 ,荧光激活细胞分离器 ( FACS calibur)检测细胞表 面 CD抗原。 1. 5 同种混合淋巴细胞反应 取脐带血 ,经淋巴细胞分离液离心后获得单个核 细胞 , PBS洗去血小板后 , 37 贴壁 2 h,去除贴壁细 胞 ,非贴壁细胞以花环沉降法获得同种异体 T细胞。 DC用完全
13、培养基悬浮 ,密度为 5 10 6 细胞 /ml,加入 丝裂霉素 C 25 g /ml, 37 孵育 45 min, Hank液洗 3 次 ,用完全培养基悬浮 ,分别以 4 10 4 细胞 /孔、 2 10 4 细胞 / 孔、 1 10 4细胞 /孔、 4 103 细胞 /孔、 2 10 3 细胞 / 孔加入 96孔圆底培养板 ,每组各 3个复孔 ,每孔 再加入同种 T细胞 2 10 5 细胞 / 孔 ,终体积为 200 l。 37 5 %CO2孵箱培养 96 h,于培养结束前 16 h加 入 3 H标记脱氧胸腺嘧啶 ( 3 H-TdR) ,每孔 1. 85 10 4 Bq 。收集细胞 ,液闪
14、计数仪 ( 1219 Rack Beta Lkb Wal- lac)检测每分钟一闪术 ( cpm)值 ,结果用 3孔均值表 示。 1. 6 共聚焦显微镜观察 DC表面抗原 HLA-DR经 FITC标记后 ,制成悬 液滴到玻片上 ,共聚焦显微镜直接观察形态及膜表面 分子分布情况。 2 结果 2. 1 DC体外培养生成 从外周血获取的 PBMC,贴壁培养 2 h后 ,获得的 贴壁细胞为单核细胞 ,加入 GM-CSF 200 ng /ml, IL-4 500 U /ml培养 2天后 ,可见贴壁的单核细胞聚集成散 布的细胞集落。培养 6天后 ,培养孔中即可见少量悬浮 细胞。加入 TNF- , 9 10
15、天时 ,大部分细胞呈悬浮状 , 且形态不规则。 另外培养板上可见有少量贴壁伸展的 巨噬细胞。 2. 2 FACS检测 培养 10天的悬浮细胞 , FACS分析显示 , 90 % 以 上细胞表达 DC特异性标志 CDla( 94. 2 % )、 CD83( 94. 2 % ) ,同时 DC高表达 HLA-A、 B 、 C( 98. 3 % ) , HLA- DR( 96. 0 % ) , 高表达共刺激 分子 CD40( 97. 7 % )、 CD80( 98. 2 % )。 见图 1 。 2. 3 共聚焦显微镜观察 共聚焦显微镜观察 ,测 量 DC的直径达 20 m以 上。 膜表面 HLA-DR
16、分子均匀分布于膜周。 2. 4 电镜观察 取培养 DC进行电镜观察。 扫描电镜显示细胞表 面有大量不规则突起 ,比较粗糙。透射电镜可见 DC的 表面突起 ,胞质中含有较多线粒体 ,较少溶酶体 (图 2)。 2. 5 DC的免疫刺激活性 同种异体混合淋巴细胞反应表明 ,本法诱导获得 的 DC在不同比例的情况下对脐带血原始 T淋巴细胞 具有强烈的激发和促增殖作用 (图 3)。 3 讨论 DC是机体内功能极强的“专职性”抗原提呈细 胞 ,外周的 DC在迁移的过程中成熟 ,表达丰富的主要 组织相容性复合物 ( MHC) 、 类分子 ,同时表达高 水平的共刺激分子和粘附分子。 DC能促进 T辅助细 胞和
17、细胞毒性 T细胞 ( CTL)的生成 ,也能促进 B细胞 生成抗体 ,在免疫应答的诱导中具有独特的地位 2, 3。 它还能分泌高水平的 IL-12,促进辅助性 T细胞 ( TH) 1 型应答 ,有助于清除病毒和恶变细胞 4。 目前 , DC在移 植免疫、肿瘤免疫、自身免疫病等方面研究倍受人们的 关注 ,尤其在抗肿瘤免疫应用中更成为近年研究的热 点。 各种形式的肿瘤抗原体外冲击的 DC用作“疫苗” 112 南 京 医 科 大 学 学 报 第 21卷第 2期 2001年 3月 图 1 培养第 10天 DC表面抗原检测 A : 透射电镜可见 , DC的表面突起 ,胞质中含有较多线粒体 , 较少溶酶体
18、 ( 10 500)。 B: 扫描电镜显示 ,细胞表面有大量不规则突起 ,比较粗糙 ( 7 000)。 图 2 电镜观察 DC超微结构 DC与 T细胞比值 图 3 DC体外刺激的脐血T细胞增殖反应 回输治疗肿瘤的研究已在国内外广泛展开 ,并在临床 治疗黑色素瘤、淋巴瘤等获得满意效果。 髓系 DC的来源有两类 ,一类是 CD34 + 干细胞 ,另 一类是 CD14 + 单核细胞。 在体外培养中 ,经细胞因子 诱导分化成 DC 。 本实验从外周血获取单个核细 胞 ,经过贴壁培养 ,纯化到单核细胞 ,经细胞因子 GM -CSF、 IL-4 、 TNF- 联合培养后 ,生成大量 DC 。 GM -CS
19、F是 DC生成所必需的 ,同时 IL-4 在 500 1000U /ml浓度时可以抑制巨噬细胞生成 ,因而联合 应用 GM-CSF和 IL-4可以促进 DC的生成 5。 加入 TNF- 后进一步促进 DC的成熟 6。研究结果表明 ,在 此培养体系中 ,能成功诱导出 CDla + DC 。 可见其呈典 型树突状外形 ,且高表达 CDla、 CD83等 DC相对特异 性表面标志。 同时还高表达 CD80 、 CD40等共刺激分 子以及 M HC- 、M HC- 类分子。 经 3 H-TdR掺入法 检测结果表明 ,本法所获 DC在体外混合淋巴细胞培 113 2期谢芳艺 ,等: 人外周血单核细胞体外诱
20、导树突状细胞及鉴定 养中能强烈激发脐带血原始 T淋巴细胞的增殖 ,证实 DC是成熟的。本研究无需在体外分离、纯化 CD34 + 造 血祖细胞 ,在很大程度上简化了操作 ,节省了物力 ,是 获取大量、高纯度成熟 DC的一种可行方法 ,为进一步 研究 DC及临床应用提供了可能。 参考文献 1Chapuls F,Rovenzwajg M,Yagello M,et al.Differenti- ation of human dendritic cells from monocytes in vitro J.Eur J Immunol, 1997, 27( 2): 431-441. 2 Steinman
21、 RM , Banchereau J.Dendritic cells and the control of immunityJ.Nature, 1998, 392(6673): 245- 252. 3 Dubois B,Vanbervliet B,Favette J,et al.Dendritic cells enhance growth and differentiation of CD40-activat- ed B lymphocytes J. J Exp Med, 1997, 185( 5): 941- 951. 4 Heufler C, Koch F, Stanzl U, et al
22、. Interleukin- 12 is produced by dendritic cells and mediates T helper l devel- opment as well as interferon- production by T helper l cellsJ.Eur J Immunol, 1996, 26( 3): 659-668. 5王月丹 ,谢玮 ,邱玉华 ,等 . 细胞因子诱导不同来源的 贴壁细胞分化为树突状细胞的研究 J. 上海免疫学杂 志 , 2000, 20( 3): 140-144. 6朱学军 ,曹雪涛 ,于益芝 ,等 . 人外周血树突状细胞的体 外扩增及
23、鉴定 J. 中国肿瘤生物治疗杂志 , 1997, 4( 4): 302-306. 收稿日期 2000-07- 17 (上接第 94页 ) 达量上 ,诱导后蛋白表达增高的有 74. 2 ku( 2. 0倍 )和 53. 1 ku( 4. 0倍 ) 2条带 ,而诱导后表达降低的则为 26. 5 ku( 2. 2倍 ) 1条带。 抗性品系 4龄幼虫经溴氰菊 酯诱导前、后 ( R幼、 R 幼)的蛋白表达无明显差异。 敏感、抗性品系雌性成蚊 ( R成 和 S 成)各有 18 、 19 条蛋白带。敏感品系有 36. 1 ku 1条特异带 ,而抗性品 系则有 97. 2 ku和 36. 9 ku 2条特异带
24、;敏感品系蛋白 表达增高的有 86. 4 ku( 3. 5倍 )和 42. 2 ku( 4. 1倍 ) 2 条带 ,而抗性品系增高的有 77. 8 ku( 3. 4倍 )、 58. 5 ku ( 4. 5倍 )和 47. 6 ku( 2. 0倍 ) 3条带。 3 讨论 杀虫剂抗性分子机理十分复杂 ,可能涉及 DNA、 RNA和蛋白质多个层面的改变。 本实验室用随机引物 扩增多态性 DNA对淡色库蚊溴氰菊酯抗性和敏感品 系的 DNA池进行了检测 ,结果在抗性和敏感品系分 别发现了 12条和 9条特异带 ,提示基因组 DNA在扩 增区有可能发生 DNA片段的插入、缺失或突变 5。本 实验室也曾报道
25、在敏感和抗性品系蚊虫中发现 51个 差异表达 cDNA6。 本文对敏感和抗性品系的成蚊和 4 龄幼虫的水溶性蛋白表达差异以及 4龄幼虫经杀虫剂 诱导前后的蛋白表达变化进行了研究。 结果表明 ,敏感 和抗性品系雌性成蚊和 4龄幼虫表达蛋白间均存在质 的差异 ,提示这些差异表达蛋白与抗性密切相关。 敏感 品系 4龄幼虫经溴氰菊酯诱导前后有质和量的差异 , 显示溴氰菊酯可阻断、开启、提高或降低某些蛋白的表 达。 吴峻等 7证实 ,敏感品系棉铃虫经戊氰菊酯诱导 后细胞色素 P450家族的 CYP6B2基因转录明显增 高 ,而抗性品系却不被诱导。 提示抗性品系昆虫可能在 转录水平上不被该杀虫剂所诱导。
26、在本研究中 ,敏感品 系经杀虫剂诱导后产生质和量的变化 ,而抗性品系 4 龄幼虫经诱导后却无明显的蛋白表达差异 ,说明经数 十代的汰选后 ,抗性品系的蛋白表达可能已不再对杀 虫剂的诱导起作用 ,提示抗性品系所具有的抗性作用 可能与某些蛋白的产生和 (或 )消失有关。 上述差异表达蛋白的获得可为今后的许多工作打 下基础。 例如 ,分离这些蛋白 ,并通过研究其生理、生化 功能确定其在抗性中所起的作用;通过制备特异蛋白 的单克隆抗体 ,对抗性直接进行检测;用制备的抗体筛 选 cDNA表达文库 ,钓取相应基因 ,以便进一步研究 等等。 参考文献 1刘维德 . 我国蚊类抗药性发展动向 J. 中国媒介生物
27、学 及控制杂志 , 1990, 1(1): 41- 43. 2 Carino Fa, Koener JF, Plapp FW, et al. Constitutive overexpression of the cytochrome P450 gene CYP6A1 in a house fly strain with metabolic resistance to insecti- cidesJ.Insect Biochem Mol Biol, 1994, 24: 411-418. 3熊美华 ,亚丁 ,徐丽娜 ,等 . 致倦库蚊幼虫与具抗性蚊 幼虫体内可溶性蛋白的比较研究 J.媒介生物学及控
28、制 杂志 , 1998, 9(1): 14-16. 4 Zhu CL, Li YL, Tian HS, et al. Study on the dynamics and mechanism of deltamethrin resistance of Culex pipi- ens pallens coquillett, 1898(diptera:culicidae)in China J. The Annals of Medical Entomology, 1995, 4(1): 1- 4. 5朱昌亮 ,田海生 ,李建民 ,等 . 用 RAPD-PCR鉴定抗溴氰 菊酯淡色库蚊 J. 中国寄生虫防治杂志 , 1998, 11( 3): 214- 216. 6田海生 ,朱昌亮 ,李秀兰 ,等 . 用 SSH和基因芯片鉴定蚊 虫抗药性和敏感性相关基因 J. 南京医科大学学报 , 2000, 20(4): 311. 7吴峻 ,庄佩君 ,唐振华 ,等 . 中国棉铃虫P450家族的 CYP6B2基因与抗药性关系 J. 生物化学与生物物理学 报 , 1999, 31( 1): 101-103. 收稿日期 2000-07- 19 114 南 京 医 科 大 学 学 报 第 21卷第 2期 2001年 3月