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1、? ? ? ? ? ?生命的化学?2005年 25卷 1期 CHEM ISTRY OF LIFE 2005, 25(1) ? Techniques and Methods 的上调。面对细胞外基质环境的改变, 通过 EGR-1 促进 MT1 - MMP的基因转录能启动内皮细胞裂隙入 侵。用 Tf 启动子突变子对内皮细胞系短暂转染实 验表明: EGR-1既介导 Tf 启动子对剪切力的应答, 也能在流体介导的 TF诱导过程中有直接作用 16。 ( 2) 持续性的骨骼肌收缩能促进新血管生成。 低电压刺激神经可导致骨骼肌持续性的收缩。而长 时间、 持续性的低电压刺激神经能中等程度增加骨 骼肌中 EGR-
2、1蛋白表达 (但未观察到 Egr-1 mRNA 改变 ) 17, 证实了骨胳肌持续性收缩可诱导 Egr-1 基因在骨骼肌的表达。 4 . 组织损伤中新血管生成与 Egr-1 Egr -1在急性损伤后可立即表达。创伤后约 12 h , 伤口边缘基底细胞的形态及内部成分开始发生变 化, 静息细胞中不表达的基因如 Egr-1开始表达。 在啮齿类动物皮肤创伤处, EGR-1可增加胶原产生、 促进新血管生成、 加速伤口的闭合 18。在损伤部 位, EGR-1也可刺激某些促进修复组织的生长因子 的产生 9。 Szabo等 19 发现新血管生成过程中, 与 内皮细胞增殖有关的蛋白质表达有赖于 EGR-1转
3、录的活化。由此认为, 用 Egr-1基因治疗可加速损 伤组织的愈合过程, EGR-1对损伤组织修复可能具 有潜在的治疗价值 18。 Egr -1基因与肿瘤的发生、 抑制、 新生血管生成 三者之间的关系极其复杂, 其机理尚有待研究。尤 其是与 Egr-1基因相关的, 对新血管生成有抑制作 用的 Egr-1 DNA核酶、 辅阻遏物 NAB2等物质能否 应用于肿瘤治疗, 值得进一步研究和探索。 参考文献 1? GashlerAL et al. M olCell Biol , 1993 , 13( 8): 4556?4571 2? Ham ilton TB et al . Biochemistry,
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8、单位? ? 细胞水平上进行 DNA或 RNA分析的 PCR方法。它为在单细胞水 平上进行产前诊断、 基因表达和 DNA 测序等领域的研究提供了简便而快捷的方法。随着该技术的不断改进和与芯 片实验室技术的结合, 单细胞 PCR在生命科学研究中将发挥更大的作用。 关键词: 单细胞 PCR; 遗传学诊断; 基因表达; DNA测序 中图分类号: Q78 收稿日期: 2004 -09-24 国家自然科学基金资助项目 (No. 30070114) 作者简介: 陈茹冰 ( 1981?), 女, 硕士生, E-mai: lrubing_chen stu . snnu . edu . cn ; 黄 ? 原 (
9、1962?), 男, 教授, 联系作者, E-mai: l yuanh snnu. edu . cn ? ? 全基因组测序的完成仅仅是了解基因及其产物 作用的第一步, 功能基因组学正向着基于单细胞的 方向进行, 使单细胞水平上的功能基因组研究成为 可能。目前已建立了多种方法来进行细胞和组织的 特定基因表达研究。然而, 常规技术在异基因型组 ?46? ? 技术与方法 ?生命的化学?2005年 25卷 1期 CHEM ISTRY OF LIFE 2005 , 25(1) 织的基因表达研究中却受到限制。单细胞聚合酶链 式反应 ( single -cell PCR )技术为人们从单细胞水平 进行基因表
10、达分析提供了途径。 1 . 单细胞 PCR 单细胞 PCR是以一个细胞所含的 DNA或 RNA 为模板的 PCR。最早以单细胞 DNA 为模板的 PCR 技术出现在上世纪 80年代后期, Jeffreys等 1 用 PCR技术扩增出单个人类淋巴细胞的小卫星 DNA, Kumar等 2用 PCR技术检测单细胞的癌基因。自 那时以来, 单细胞 PCR技术开始被应用于一些特定 的医学和神经生物学研究领域。近年来, 随着人们 对单细胞水平上分析的需求, 单细胞 PCR开始向更 多的生物学领域渗透, 为在单细胞水平上进行产前 诊断、 基因表达、 DNA 测序等领域的研究提供了简 便而快速的方法。 2 .
11、 单细胞 PCR技术的特殊性 与普通 PCR 相比, 单细胞 PCR 在细胞识别与 分离、 模板制备、 扩增反应策略方面有一定的特殊 性。 2 . 1? 单细胞的识别与分离技术 ? 特定类型单细 胞的识别与分离是进行单细胞 PCR的第一步, 也是 最重要的一步。对于培养的细胞或其他游离细胞, 可在倒置显微镜下手工机械分离或通过流式细胞仪 分离 3, 4, 对于有许多细胞类型的实体组织 (如神经 组织 )可首先通过细胞特异性染色方法或细胞表面 特异性抗原的荧光免疫技术识别出特定的细胞, 然 后采用激光捕获解剖法 ( laser capture m icrodissec - ton , LCM )
12、从组织中切割出细胞 5, 或先利用酶消 化, 使其解离为单个细胞, 再用荧光染料染色, 然后 利用荧光激活细胞分选法 ( fluorescence activated cell sorting ,FACS)挑选出所需的细胞 6。 2 . 2? 模板的制备 ? ? 一旦分离出单细胞后, 按照所 研究分子的特征裂解细胞, 使靶分子游离出来, 以便 于检测。 ( 1) DNA模板的制备 ? 最常用的方法为蛋白酶 K 裂解法。一个成熟的体系为: 首先, 将挑选的单细胞 置入含有 10 ?L细胞裂解缓冲液的离心管中。缓冲 液成分为:50mmol/L Tris-HC l( p H 8 . 5), 1mmo
13、l/L EDTA,0 . 5% Tween-20 ,200 mg/L 蛋白酶 K, 然后 在 55 ? 培育 2 h 。最后在 95 ? 加热 10m in使蛋白 酶 K变性 7。蛋白酶 K浓度、 培育温度和时间可做 调整。 ( 2) RNA模板的制备? 对于新鲜的样品, 常常直接 用膜片钳将细胞内含物吸出, 加到含有 RNA酶抑制 剂的 RT-PCR缓冲液中 8。另外, 如采用蛋白酶 K 裂解细胞, 常进一步将 mRNA分离出来。通常采用 加入带有寡聚 dT 的纤维素柱, 使其吸附 mRNA, 然 后洗脱出 mRNA 3。 对于固定样品 RNA的提取, 主要是在裂解细胞 之后用各种方法将核酸
14、沉降下来 9。 2 . 3? 单细胞 PCR反应体系 ? 与普通 PCR相比, 单细胞 PCR要求反应体系十分灵敏和高效, 所以如 何提高 PCR体系的灵敏度和效率是单细胞 PCR成 功的关键因素。主要是利用各种技术来弥补有限的 模板数量。 ( 1) 引物延伸预扩增与多重 PCR? 引物延伸预扩增 ( pri m er extension preamplification , PEP)就是采用 10 15个碱基的随机引物, 在 DNA 聚合酶的作用下 做一次全基因组范围的随机扩增, 把原有的基因组 拷贝数放大数十倍, 其产物可为进一步研究提供充 足的模板, 同时可以扩增多个基因。 Zhang等
15、 10 较 深入地研究了 PEP的效率, 认为单个拷贝的单倍体 细胞 PEP后至少可使 78 % 的基因组序列复制 30倍 以上, 因此很适用于单细胞基因研究。多重 PCR采 用两次套式扩增, 第一轮反应取 PEP反应产物多份 作为模板, 分别加入各待测基因的外引物, 按常规 PCR方法进行扩增。第二轮反应以第一轮反应产 物为模板, 加入内引物扩增 11。多重 PCR 技术的 改良是当前研究的焦点之一, 如 Moutou等 12 介绍 的多重荧光 PCR法。 ( 2) 单细胞 RT-PCR? 用单细胞进行表达图谱研究 时要尽量保证细胞内分子信息的完整性。最好采用 新鲜分离的细胞, 如用固定或染
16、色的细胞, 则需采用 多个细胞分别分析, 而用乙醇、 甲醇固定的细胞要比 用丙酮或福尔马林固定的细胞效果较好 9。 为了解决 RT-PCR模板少的问题, 在 PCR这一 步可以适当调高循环次数, 约为 40次 13, 也可采 用巢式、 半巢式 PCR和多重 PCR来解决 14。另外, 也可先使用 3? 端扩增 ( TPEA) PCR法全面的扩增单 细胞表达的全部 mRNA, 以增加模板量 15。 ( 3) 实验注意事项 ? 在分离、 裂解和扩增等每一个 步骤都要严格防止污染。扩增前后的实验应在不同 楼层的房间内进行。材料和试剂在房间之间应为单 向流动。为区别实验误差, 每次实验应选取多个细 胞
17、进行检测, 以得到可靠的统计数据。利用细胞外 液体作为对照, 并尽量采用多个对照。 3 . 单细胞 PCR的应用 3 . 1? 植入前诊断及母体血液胚胎细胞诊断 ? 植 ?47? ? ? ? ? ? ?生命的化学?2005年 25卷 1期 CHEM ISTRY OF LIFE 2005, 25(1) ? Techniques and Methods 入前遗传学诊断 ( prei mplantation genetic diagnosis, PGD)是建立在体外受精 ( in vitro fertilization ,IVF) 和早期胚胎活检 ( early embryo biopsy)技术基础
18、上, 采用聚合酶链式反应或荧光原位杂交技术对待植入 母体的胚胎进行遗传缺陷诊断的一种方法。单细胞 PCR的出现极大地推动了 PGD技术的发展。它首 先被用于为人类植入前胚胎活体检测 X连锁遗传 病的单细胞测定性别, 并很快被扩展到检测许多其 他单基因遗传病中, 如 X连锁的假肥大型肌营养不 良 ( Duchenne?s muscular dystrophy ,DMD), 常染色 体显性遗传的马方综合征 (M arfan syndrome), 以及 常染色体隐性遗传的血红蛋白病 ( haemoglobinopa - thy)等。 从母体血液中分离胚胎细胞是一种安全且有效 的胚胎遗传病诊断方法。在
19、妊娠期, 胚胎造血细胞 ( haemopoietic)进入母体血流, 通过富集和分离即可 得到这种细胞。这些细胞在血流中含量非常低, 仅 相当于母体细胞的百万分之一。因而它的富集也十 分富有挑战性, 一般通过荧光激活细胞筛选法 ( fluo - rescen- t activated cell sorting,FAC)或磁性细胞分类 法 ( magnetic cell sorting , M acs)来实现 16。 3 . 2? 单细胞基因表达谱的研究 ? 单细胞 RT- PCR技术的成熟使单细胞基因表达谱得到了广泛 的研究, 被应用于神经生物学、 免疫学、 发育生物学, 以及肿瘤研究等各个方
20、面。这就避免了组织水平分 析时造成的异质细胞干扰, 使得基因表达研究更加 精细、 准确。 由于神经元体积通常较大, 所以单细胞 PCR技 术很早就用于神经元的研究中, 到目前为止也是应 用最多的一个领域。 Ginsberg 等 17 对单细胞基因 表达分析在神经疾病中的研究做了综述。 基于单细胞水平的免疫研究是要找出同种免疫 细胞间由基因重排而形成的差异。例如, H ug等 18 在柔脑脊髓瘤的研究中, 利用单细胞 PCR检测 B细 胞的免 疫 球蛋 白重 链 ( Ig H ) 第三 互 补决 定区 ( CDR3), 得以从应答的多克隆 B细胞中鉴别出单 克隆肿瘤细胞 (这是无法用其他方法检测
21、出的 )。 单细胞分析对于发育过程的理解也有着重要意义。 W ardle等 19 将原位杂交和单细胞 RT-PCR技术相 结合, 研究了爪蟾胚胎在囊胚期和原肠胚期阶段不 同区域细胞的基因表达图谱, 这些基因通常在早期 和晚期原肠胚的外、 中、 内胚层表达, 由此可推断这 些细胞在不同阶段的分化及位置。 3 . 3? 单细胞 DNA测序? 这一方面的研究主要是 对于线粒体 DNA的测序, 从而找出导致疾病的突 变。近年来已有很多科学家将目光投向对线粒体致 病机理的研究。 利用单细胞 PCR技术, Nekhaeva等 20 发现线 粒体 DNA 点突变在细胞内的克隆扩增是正常人体 组织的普通事件,
22、 证实了这些点突变在老化和疾病 衰退等生理过程的作用。He等 3将实时荧光定量 PCR结合到单细胞线粒体研究中, 以测量单个细胞 内突变线粒体的比例。另外, 对于长片段缺失的研 究, 则要借助于线粒体全基因组的测定。 Taylor 等 7设计的两步法 PCR策略保证了从单细胞中精 确扩增和测序整个人类线粒体基因组。 近年来, 单细胞 PCR以及单细胞 RT-PCR技术 已成为免疫学、 神经生物学, 以及临床指导的病理研 究的有力工具。随着技术的改进, 如荧光实时定量 PCR的发展及与芯片实验室的结合, 使得单细胞水 平基因表达分析进入了新的阶段。 参考文献 1?Jeffreys AJ et a
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