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1、细胞培养基础篇基础篇-无菌操作基本技术 1. 实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminar flow) 以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以70% ethanol擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70% ethanol 擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转10分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。 2. 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气
2、流之流通。实验用品以70% ethanol擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在台面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。 3. 小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。 4. 工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台（至少Class II）。操作过程中，应避免引起aerosol之产生，小心毒性药品，例如DMSO及TPA等，并避免尖锐针头之伤害等。 5.
3、定期检测下列项目： 5.1. CO2钢瓶之CO2压力。5.2. CO2培养箱之CO2浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)。 6. 水槽可添加消毒剂（Zephrin 1:750），定期更换水槽的水。基础篇-血清 1. 血清必须贮存于2070，若存放于4，请勿超过一个月。如果一次无法用完一瓶，可将4045ml 分装于无菌50ml离心管中，由于血清结冻时体积会增加约10 %， 必须预留此膨胀体积之空间，否则易发生污染或容器冻裂之情形。 2. 一般厂商提供之血清为无菌，不需再无菌过滤。若发现血清有许多悬浮物，则可将血清加入培养基内一起过滤，勿直接过滤血清。3. 瓶装(500ml)
4、 血清解冻步骤(逐步解冻法)：20至4冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装，一般以50ml无菌离心管可分装4045 ml。在溶解过程中须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡)，使温度与成分均一，减少沉淀的发生。勿直接由20直接至37解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沈淀。 4. heat-inactivation 是指56, 30 分钟加热已完全解冻之血清。加热过程中须规则摇晃均匀。此热处理之目的是使血清中之补体成份(complement) 去活化。除非必须，一般不建议作此热处理，因为会造成沉淀物之显著增多，且会影响血清之品质。补体参与之反应有：cytolytic activities, c
5、ontraction of smooth muscle, release of histamine from mast cells and platelets, enhanced phagocytosis, chemotaxis and activation of lymphocytic and macrophage cell type。 5. 勿将血清置于37太久，若在37放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定之成份亦会因此受到破坏，而影响血清之品质。 6. 血清之沉淀物 6.1. 凝絮物：发生之原因有许多种，但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein) 变性及解冻后血清
6、中存在之血纤维蛋白(fibrin) 造成，这些凝絮沉淀物不会影响血清本身之品质。若欲减少这些凝絮沉淀物，可用离心3000rpm, 5min去除，或离心后上清液可以加入培养基中一起过滤。不建议用过滤步骤去除这些凝絮沈淀物，因为会阻塞过滤膜。基础篇-细胞传代培养 1. 细胞生长至高密度时，即须分殖至新的培养瓶中，一般稀释比例为1:3 至1:6，依细胞种类而异。2. 材料： 2.1. 无菌磷酸生理缓冲液(Dulbeccos phosphate-buffered saline, Ca+/Mg+ free, D-PBS, GibcoBRL 21600-010) 2.2. trypsin-EDTA sol
7、ution (0.05% trypsin-0.53mM EDTA-4Na, GibcoBRL 25300-062)： 以10ml 分装于15ml无菌离心管中，保存于20，使用前放在37水槽回温。 2.3. 新鲜培养基 2.4. 无菌吸管/离心管/培养瓶 3. 步骤： 3.1. 附着型细胞（adherent cell）3.1.1. 吸掉旧培养液。 3.1.2. 用D-PBS洗涤细胞一至二次。 3.1.3. 加入trypsin-EDTA 溶液(1ml/25cm2, 2ml/75cm2)，37作用数分钟，于倒立显微镜下观察，当细胞将要分离而呈现圆粒状时，吸掉trypsin-EDTA溶液。(若不移去t
8、rypsin-EDTA，则在trypsin-EDTA作用后，加入适量含血清之新鲜培养基终止trypsin作用，离心后再吸掉上清液)。3.1.4. 轻拍培养瓶使细胞自瓶壁脱落，加入适量之新鲜培养基，以吸管上下吸放数次以打散细胞团块，混和均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，以正常培养条件培养。 3.2. 悬浮型细胞(suspension cell) 3.2.1. 吸出细胞培养液，放入离心管中，离心1000 rpm 5 分钟。 3.2.2. 吸掉上清液，加入适量之新鲜培养基，混和均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，以正常培养条件培养。 3.3. 融合瘤(hybridoma) 3.3.1. 有些h
9、ybridoma cell 需培养三天以上才会产生抗体，若是更换培养基，则可能会失去抗体。因此继代培养不需离心后更换培养基，直接添加新鲜培养基稀释细胞浓度即可。若体积太大，可倾斜放置，或分殖至新培养瓶中。 基础篇-细胞冷冻保存1. 注意事项： 1.1. 欲冷冻保存之细胞应在生长良好（log phase）且存活率高之状态，约为8090致密度。 1.2. 冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。1.3. 注意冷冻保护剂之品质。DMSO应为试剂级等级，无菌且无色(以0.22micronFGLP Telflon过滤或是直接购买无菌产品，如S
10、igma D-2650)，以510 ml小体积分装，4避光保存，勿作多次解冻。Glycerol 亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。1.4. 冷冻保存之细胞浓度：1.4.1. normal human fibroblast: 13*106 cells/ml 1.4.2. hybridoma: 13 x 106cells/ml，细胞浓度不要太高，某些hybridoma会因冷冻浓度太高而在解冻24小时后死去。 1.4.3. adherent tumor lines: 57 x 106，依细胞种类而异。Adenocarcinoma 解冻后须较高
11、之浓度，而HeLa 只需1-3 x 106cells/ml。 1.4.4. other suspensions: 510 x 106cells/ml, human lymphocyte 须至少5 x 106cells/ml。 1.5. 冷冻保护剂浓度为5或10 DMSO，若是不确定细胞之冷冻条件，在做冷冻保存之同时，亦应作一个backup culture，以防止冷冻失败。 1.6. 冷冻方法： 1.6.1. 传统方法: 4 10分钟- -20 30分钟- -80 16-18小时(或隔夜) - 液氮槽vapor phase 长期储存。 1.6.2. 程序降温：利用等速降温机以13/分钟之速度由室
12、温降至120，放在液氮槽vapor phase长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。 2. 材料：2.1. 生长良好之培养细胞 2.2. 新鲜培养基 2.3. DMSO (Sigma D-2650) 2.4. 无菌塑料冷冻保存管(Nalgene 5000-0020) 2.5. 0.4 w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061) 2.6. 血球计数盘与盖玻片 2.7. 等速降温机(KRYO 10 Series II) 3. 步骤： 3.1. 冷冻前一日前更换半量或全量培养基，观察细胞生长情形。3.2. 配制冷冻保存溶液(使用前配制)：将DMSO加入新
13、鲜培养基中，最后浓度为5-10，混合均匀，置于室温下待用。 3.3. 依细胞继代培养之操作，收集培养之细胞，取少量细胞悬浮液(约0.1 ml)计数细胞浓度及冻前存活率。3.4. 离心，去除上清液，加入适量冷冻保存溶液，使细胞浓度为1-5 x 106 cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1 ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。 3.5. 冷冻保存方法1: 冷冻管置于4 10 分钟 -20 30分钟 -80 1618小时(或隔夜)液氮槽vapor phase长期储存。 3.6. 冷冻保存方法2: 冷冻管置于已设定程序之等速降温机中，再放入液氮槽中。程序为: pro
14、gram 7: HB CELL 基础篇-冷冻细胞活化 1. 冷冻细胞之活化原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，导致细胞之死亡。 2. 细胞活化后，约需数日，或继代一至二代，其细胞生长或特性表现才会恢复正常(例如产生单株抗体或是其它蛋白质)。 3. 材料： 37 恒温水，新鲜培养基，无菌吸管/ 离心管/ 培养瓶，液氮或干冰容器 4. 步骤： 4.1 操作人员应戴防护面罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害。 4.2 自液氮或干冰容器中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉。 4.3 将新鲜培养基置于37 C水槽中回温，回温后喷以70 % 酒精并擦拭之，移入无菌
15、操作台内。 4.4 取出冷冻管，立即放入37 C 水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化，以70% ethanol 擦拭保存管外部，移入无菌操作台内。4.5 取出0.9 ml解冻之细胞悬浮液，缓缓加入有培养基之培养容器内(稀释比例1:101:15)，混合均匀，放入CO2 培养箱培养。另取0.1 ml 解冻细胞悬浮液作存活测试。4.6 解冻后是否立即去除冷冻保护剂(例如DMSO或glycerol)，依细胞种类而异，一般而言，大都不需要立即去除冷冻保护剂。若要立即去除，则将解冻之细胞悬浮液加入含有5-10 ml 培养基之离心管内，离心1,000 rpm, 5 分钟，移去上清液，加入新鲜培
16、养基，混合均匀，放入CO2 培养箱培养。 4.7 若不需立即去除冷冻保存剂，则在解冻培养后隔日更换培养基。附-细胞计数与存活测试 1. 原理： 1.1. 计算细胞数目可用血球计数盘或是Coulter counter粒子计数器自动计数。 1.2. 血球计数盘一般有二个chambers，每个chamber中细刻9个1 mm2 大正方形，其中4个角落之正方形再细刻16个小格，深度均为0.1 mm。当chamber 上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1 mm2 x 0.1 mm=1.0 x 10-4 ml。使用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104，即为每ml 中之细胞数目。