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1、从细胞中提取RNA得方法1。加入 00ul 得 Trizo 将细胞悬浮起来 , 在室温下 (15-3 C) 用手摇均 , 放置 5 分钟以上 ;2。涡旋秒后 , 将样品轻离至底部 , 加入 160l 得氯仿 , 再涡旋 30 秒, 室温放置 25 分钟 ;、 用 4C离心机 , 3000rpm 离心 15 分钟 , 使样品分层 ;4。 将最上面得水相溶液层转移到新得1、7m离心管中 , 加入 2ul得糖原 Gu gn;5、再加入 400ul 冰上预冷得异丙醇sopro ao, 摇均、-20 C放置小时或过夜 ;.用 C离心机 ,1 000pm 离心 15 分钟 , 弃上清 ;7. 加 200l
2、 75 无 RNase酶得酒精洗 RA,1000rpm离心 5 分钟;。 弃上清 , 尽量不要碰到 RNA Pillet;。在超净台上 , 干燥大约 8 分钟 ;10。 用无 Nase酶得去离子水或就是 EPC Wt r 溶解 RA, 在室温下静置 10 分钟 , 待 RNA完全溶解 , 保存在 -80 C( 或就是立刻做RT-PCR,翻转成 cDNA保存在 20C) 、注 : 1l Tri l-10 x 106 clls;1 x 10bacerial cell。At R , lyismns、特点 i ol 试剂可以快速提取人、 动物、植物、细菌不同组织得总 RNA,该方法对少量得组织 ( 0
3、1 0 m) 与细胞 (5 106) 以及大量得组织 ( g) 与细胞 ( 07) 均有较好得分离效果。 TRIZOL试剂操作上得简单性允许同时处理多个得样品。所有得操作可以在一小时内完成。 T IZO抽提得总 NA能够避免 DNA与蛋白得污染。故而能够作 RNA 印迹分析、斑点杂交、 poly(A)+ 选择、体外翻译、 RN酶保护分析与分子克隆。如果就是用于 CR,当两条引物位于单一外显子内时 , 建议用级联扩大得 Nase I( at 、 No. 18068) 来处理抽提得总 RA。并且利用 N、RNA与蛋白质在不同溶液中得溶解性质 , 可以通过分层分别将不同层中得 RNA( 上层 ) 、
4、DNA(中层 ) 、蛋白质 ( 下层 ) 分离纯化出来 , 效率极好。Trizo 试剂能促进不同种属不同分子量大小得多种 N得析出。例如 , 从大鼠肝脏抽提得 RNA琼脂糖凝胶电泳 并用溴化乙啶染色 , 可见许多介于 7 kb 与 15 kb 之间不连续得高分子量条带 ,( RNA与 hnRN成分 ) 两条优势核糖体 NA条带位于 5 kb (28 ) 与 kb ( 8S), 低分子量介于。 1 与 0.3 b之间 ( RNA, 5) 。当抽提得 RNA用 E 稀释时其 A26/A 0 比值、 8折叠 编辑本段使用方法1. 样品得制备 当样品富含蛋白质 , 脂肪 , 多糖或就是细胞外物质例如肌
5、肉 , 脂肪组织与植物得块茎部分时可能需要一额外得分离步骤。 匀浆化后在 - 8C得条件下以 12,000 g得离心力离心 10 分钟 , 移除匀浆中不溶解得物质 , 余下得沉淀中包含有细胞外膜 , 多糖 , 以及高分子量 N, 而上层得超浮游物含有 RNA。在来自于脂肪组织得样品中 , 大量得脂肪漂在最上层因而应该除掉。 在每一个个案中 , 将清亮得匀浆溶液转移到一干净得试管中加入氯仿并继续进行下述得分离步骤。2。 分离阶段 将匀浆样品在 530C条件下孵育 5 分钟以使核蛋白体完全分解、每 l TRIZO加 0、2 ml 氯仿。盖紧样品管盖 , 用手用力摇晃试管 5 秒并将其在 3下孵育
6、23 分钟。在 2- 8C下以不超过 12, 00得离心力高速冷冻离心 5 分钟。离心后混合物分成三层 : 下层红色得苯酚氯仿层 , 中间层 , 上层无色得水样层。 R A 无一例外地存在于水样层当中。水样层得容量大约为所加 TRIOL容量得 60%。3、 NA得沉淀 将水样层转移到一干净得试管中, 如果希望分离 DNA与蛋白 , 有机层同样要予以保留。通过将水样层与异丙醇混合来沉淀 RN。最初均化时得每 1 ml RZ对应。 ml 异丙醇。将混合得样品在 15 0条件下孵育 10 分钟并在 2- 8下以不超过 12,000 得离心力高速冷冻离心 10 分钟。 NA沉淀在离心前通常不可见 ,
7、形成一胶状片状沉淀附着于试管壁与管底。4 、RNA得洗脱 移去上层悬液。用 75得乙醇洗涤 R沉淀一次 , 每 l得 I O至少加 1 得 75乙醇。旋涡振荡混合样品并在 2- 8C下以不超过 7,50 g得离心力高速冷冻离心 5 分钟。5、RA得再溶解 在操作得最后 , 简单干燥 RNA沉淀 ( 空气干燥或真空干燥 510 分钟 ) 不要在真空管里离心干燥 RNA。尤为重要得就是 , 不能让 RNA沉淀完全干燥那样会极大地降低它得可溶性。 部分溶解得 RNA样品其 A260/280 比值 1 、用移液管尖分几次移取无 RA 酶得水或。 5 溶液来溶解 NA,并在5560C下孵育 10 分钟
8、( 当 N以后要用于酶切反应时 , 避免使用 S S、 )RN 还能被 0甲酰胺 ( 除去离子 ) 再溶解并保存在 C。折叠编辑本段使用 TR l 注意事项 I ol 对人体有害 , 使用时应戴 一次性手套 , 注意防止溅出。样品得制备当样品富含蛋白质, 脂肪 , 多糖或就是细胞外物质例如肌肉, 脂肪组织与植物得块茎部分时可能需要一额外得分离步骤。匀浆化后在 - C得条件下以 12,000 得离心力离心 10 分钟 , 移除匀浆中不溶解得物质 , 余下得沉淀中包含有细胞外膜 , 多糖 , 以及高分子量 DNA,而上层得超浮游物含有 NA。在来自于脂肪组织得样品中 , 大量得脂肪漂在最上层因而应
9、该除掉。 在每一个个案中 , 将清亮得匀浆溶液转移到一干净得试管中加入氯仿并继续进行下述得分离步骤。分离阶段将匀浆样品在15 0C条件下孵育 5 分钟以使核蛋白体完全分解。每 1m TRIZOL加 0、2l 氯仿、盖紧样品管盖 , 用手用力摇晃试管 1秒并将其在 3C下孵育 23 分钟、在 8C下以不超过 1,00 g得离心力高速冷冻离心 15 分钟、离心后混合物分成三层 : 下层红色得苯酚氯仿层 , 中间层 , 上层无色得水样层。 RNA无一例外地存在于水样层当中。水样层得容量大约为所加 RIZOL容量得 6。 A得沉淀将水样层转移到一干净得试管中, 如果希望分离 DNA与蛋白 , 有机层同
10、样要予以保留。通过将水样层与异丙醇混合来沉淀 RNA。最初均化时得每 1 lT I OL对应 0。 5m异丙醇。将混合得样品在 15- 30C条件下孵育 10 分钟并在 2下以不超过 12, 0g得离心力高速冷冻离心 10 分钟。N沉淀在离心前通常不可见 , 形成一胶状片状沉淀附着于试管壁与管底、4。 NA得洗脱移去上层悬液。用75得乙醇洗涤 NA沉淀一次 , 每 1 l 得 TR ZOL至少加 1l 得 75%乙醇、旋涡振荡混合样品并在 2- 8C下以不超过 7,50得离心力高速冷冻离心 5 分钟。RNA得再溶解在操作得最后, 简单干燥 RNA沉淀 ( 空气干燥或真空干燥5 10 分钟 )
11、不要在真空管里离心干燥 RNA、尤为重要得就是 , 不能让 RN沉淀完全干燥那样会极大地降低它得可溶性。部分溶解得 RN样品其 A2 /280 比值 1、6。用移液管尖分几次移取无 RNA酶得水或 0。5SDS溶液来溶解 RA, 并在 55- 0C下孵育分钟 ( 当 RNA以后要用于酶切反应时 , 避免使用 SDS。)RA 还能被 10 %甲酰胺 ( 除去离子 ) 再溶解并保存在 7。 NA抽提注意事项1。从少量得组织 (1 1 m ) 或细胞 ( 0210 ) 中分离 RNA样品 : 往组织或细胞中加入 800 l TRIZOL 。待样品裂解后, 加入氯仿并进行步骤中得抽提操作。在用异丙醇沉淀 RNA之前 , 加入 5 0无 N酶得脂质体 (Cat.No 10814) 作为水样层得载体。 为降低其黏度在加入氯仿前用 6 号注射器抽吸两次以切断基因组 DNA。脂质体会留在水样层中并与 R共析出、在浓缩到 4 mg/ml 之前它不会抑制第一丝状体得合成也不会抑制 PCR。2、在匀化后与加入氯仿之前 , 样品可以在 0 70C保存至少一个月。 RNA 沉淀 ( 步骤 4,RN洗脱 ) 溶于 5得乙醇在 - C至少可以保存一周 , 在 5C 下至少可保存一年。、台式离心机最大能达到 , 0g得离心力 , 如果将离心时间延长到 0 60 分钟可以满足步骤 2 与步骤 3 中得操作。