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1、常用得单克隆抗体检测方法通过杂交瘤技术制备单克隆抗体，在杂交瘤制备完成后，需要对抗体进行一个检测,本文介绍了几种常用得抗体检测得方法（ 1)免疫酶技术免疫酶技术就是将抗原抗体反应得特异性与酶对底物显色反应得高效催化作用有机结合而成得免疫学技术。由于它特异性强 ,灵敏度高 ,现已广泛用于筛选与鉴定单抗。器材与试剂 a、包被缓冲液：碳酸盐缓冲液：取0、2mol/LN 2CO3 8m ，0、2mol/ NaHCO3 17ml混合 ,再加75ml蒸馏水,调 H至9、6。TrH l缓冲液(、0，0、02mo/L):取0、 mol/Li1 0ml,0 、1 ol/ H l 5 、4ml混合 ,加蒸馏水至1
2、 00ml 。、洗涤缓冲液(PH7 、 2得B): H2 O0、 2g， KCl 0 、， Na2H O4 2H2O 、 g,N C8、 g, ween20 0、 5 l，加蒸馏水至 100ml 。 c、稀释液与封闭液：牛血清白蛋白 (BSA)0 、 ,加洗涤液至 100ml ；或用洗涤液将小牛血清配成 5 10%使用。 d、酶反应终止液 (2mol/ H2SO):取蒸馏水1 8、3ml ，滴加浓硫酸 （ 98%）21、7ml 。e、底物缓冲液（ PH5、 0，磷酸盐柠檬酸缓冲液） ：取 0、 2mol/L Na HPO 25、7ml,0 、1ml/L 柠檬酸 4、3m，再加 50ml 蒸馏水
3、柠檬酸溶液及配成得底物缓冲液不稳定 , 易形成沉淀 ,因此一次不宜配制过多。 f 、底物使用液： OPD 底物使用液 ( 测 49nm 得 OD 值）: PD g,底物缓冲液10m ,3 2O2 0、1 ml 。 MBS 或 TMB 底物使用液 ( 测450nm 得 O值 )： TMBS 或 T (1mg l） 1、 0ml, 底物缓冲液 0 l,1%H2 2 25 l。 T底物使用液 （测1 nm 得 O值） : BT 0、5mg,底物缓冲液 ml ，3% H2 2 2ul。 g、抗体对照 :以骨髓瘤细胞培养上清作为阴性对照,以免疫鼠血清作为阳性血清 .h、抗原 : 可溶性抗原 :尽量纯化,
4、以获得高特异性。 病毒感染得传代细胞或全菌抗原。 淋巴细胞等悬液。 、酶标抗鼠抗体或酶标 SPA 或其她类似试剂。j、 细胞固定液 :-2丙酮 ;或丙酮甲醛固定液： N PO4 10mg,KH2P 4 500mg,蒸馏水 15 m，丙酮 225l ，甲醛 125ml ；或丙酮甲醛溶液 (1；1)；或 -20甲醇。 k、聚苯乙烯微孔板： 0 孔、 96 孔、或条孔；硬板或软板均可使用、酶联免疫阅读仪 ;或光镜 .m、吸管、加样器及水浴箱、离心机等。 可溶性抗原得酶联免疫吸附试验(ELI ）、纯化抗原用包被液稀释至1- 0ug/ml 。、以 50-100ul/ 孔量加入酶标板孔中，置过夜或3吸附2
5、 小时。 c、弃去孔内得液体，同时用洗涤液洗3 次,每次 -分钟 ,拍干。 d、每孔加 200ul 封闭液 4过夜或 37封闭小时；该步骤对于一些抗原 ,可省略。 e、洗涤液洗 3次;此时包被板可 -2或 4保存备用。 f 、每孔加 0-100ul 待检杂交瘤细胞培养上清,同时设立阳性、阴性对照与空白对照;3孵育 1 2 小时;洗涤，拍干。 g、加酶标第二抗体,每孔 50-1 0ul,3孵育 2 小时，洗涤 ,拍干。 h、加底物液，每孔加新鲜配制得底物使用液50 10 u， 37 10- 0 分钟。、以2ol/L 2SO4 终止反应，在酶联免疫阅读仪上读取O值 .、结果判定 :以 P/N2 、
6、1,或 PN+ D 为阳性。 若阴性对照孔无色或接近无色 ,阳性对照孔明确显色，则可直接用肉眼观察结果。全菌抗原得 EL S a、新鲜培养得细菌用蒸馏水或 PB悬浮 ,并调整细菌浓度至 1 08 个 /m。必须指出，对于人畜共患病病原体需注意安全操作,最好就是灭活处理。b、每孔中加 00 l %戊二醛溶液 (、 1mol/L NaHCO 5m 25戊二醛溶液 5m ), 7作用 2 小时，蒸馏水洗涤 3 次 ;加上述细菌悬液 0ul 孔；37-5烘干； 每孔加 2 0ul 封闭液 4过夜或 3 小时封闭 .c、步骤 b 也可采用先每孔加 5 u细菌悬液， 37 6烘干，然后用 2预冷得无水甲醇
7、室温作用15 分钟 ,蒸馏水洗涤次 ;每孔加 20 u封闭液 4过夜或 3 小时封闭。、洗涤液洗次 ;此时包被板可在 0或 4保存备用 .e、以下步骤同上法。用全细胞抗原得ELIS a、按常规方法培养细胞 ,接种病毒，收获感染细胞与未感染细胞,进行细胞计数，用 P S 制成适当浓度悬液。、淋巴细胞悬液得制备采用新鲜外周血加肝素抗凝后，滴加于淋巴细胞分离液之上，1 00rpm 离心 3分钟 ,吸取界面细胞洗涤二次， 即为新鲜淋巴细胞悬液 .该细胞悬液中若仍混有红细胞， 离心后加 0、 3%得氯化铵溶液， 室温 1分钟 ,洗涤一次即可。 将该细胞悬液稀释至适当浓度。 c、每孔加 00ul 上述或
8、b 得细胞悬液，使每孔含细胞 5 104 个 ;1500r/min 15 分钟，甩去上清；室温干燥或吹干后用丙酮甲醇（：1)固定 1分钟 ;可或 2保存备用。d、以下步骤同上法。抗体捕捉 EL SA 试验本法用抗 ALB c 小鼠 Ig 得多克隆抗体捕捉待检样品中得 cAb ，再依次加抗原、酶标多克隆抗体及底物显色。该法就是常用得 ELI A 中较理想得一种；其操作步骤如下： a、以适当浓度得纯化抗鼠 Ig 抗体包被酶标板 ,每孔加 100u， 3 2 小时或 4过夜。 b、洗涤、拍干后加待测得 cAb 样品 , 7 1 2 小时。 c、洗涤后加适量得抗原 ,37 小时。 d、洗涤后加入酶标多
9、克隆抗体 ,371-2 小时。洗涤后加底物显色，判定结果。ABC-E I 试验 A ELI A 就是在常规ELIS 原理得基础上,增加了生物素 (Biotin) 与亲与素（ Avdin) 间得放大作用。亲与素有个亚单位组成，对生物素有高度得亲合力。生物素很易与蛋白质共价结合。因此，结合了酶得亲与素与结合有抗体得生物素发生反应即起到了多极放大作用。其操作步骤如下:a、已知抗原得包被及加待检Mc b样品,同间接ELISA试验。b、加生物素化抗鼠抗体,每孔100ul ，371 小时；洗涤。c、加酶标亲与素，每孔10 l,3 30 分钟洗涤 ;加底物显色 ,判定结果。 Dot-EL A 试验免疫斑点试
10、验（ ot-ELISA) 就是以硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜为固相载体 ,进行抗原抗体反应得免疫检测手段。 该法采用不溶性底物 (如 AB, 或 4氯萘酚或 Ag 3 等）,其与相应标记物（ HRP、 AP、胶体金）作用形成不溶性产物 ,呈现斑点状着色,从而易于判定结果。 根据所用得标记物不同， 可分为 HRP免疫斑点试验、免疫斑点试验与免疫金银斑点法等。其操作步骤大致如下 :a、将抗原液 2-5u 点加于纤维素膜上 ,室温 7干燥 .b、将纤维膜浸入封闭液中， 37 3分钟。 c、用洗涤液洗 2 次 ,吸干后加待检 McAb 样品 ,7 1 小时 ;用洗涤液振荡洗涤三次 ,每次 5 分钟，加
11、HRP 或 AP 或胶体金标记得抗鼠抗体 , 7作用分钟。 d、同法洗涤，吸干，用新配得相应底物溶液显色 ,然后水洗终止反应 ,观察结果免疫组化染色法该法主要用于检测针对细胞抗原成分得 Ab, 常用得方法就是间接免疫过氧化物酶试验(IIP,indir c mmunoper xidase)及 APAAP 技术。其结果用光镜或倒置显微镜检查.(）免疫荧光技术免疫荧光技术可用于多种抗原得杂交瘤抗体检测,如细胞性抗原 (包括细菌与动物细胞）、感染细胞中得病毒抗原与膜抗原等。其操作简单、敏感性高 ,可直接观察抗原定位等优点,在 cAb 得筛选与鉴定上具有重要得应用价值。器材与试剂a、供检测抗体用得抗原制
12、备固定细胞片或板，活细胞悬液。、PBS(、， 0、 m l/L)c 、待检得 McAb 样品。 d、冷丙酮 e、FITC( 异硫氰酸荧光素 )或 TRITC( 四甲基异硫氰酸罗丹明荧光素）标记得抗鼠 g 抗体等 f 、荧光显微镜 ,磁力搅拌器，离心机，水浴箱等。间接免疫荧光法 a、固定细胞片得制备 :生长在盖片上得细胞 (接种或未接种病毒） ,可直接收获盖片 ,在中洗涤， 用丙酮固定 0 分钟 ,空气干燥 ,置密封容器于 -20保存备用 ;单细胞悬液可在盖片上制成涂片,固定方法同上。 细胞涂片得制备:将 10ul 细菌悬液 （ 1 8 个 ml) 涂抹 7 1m盖片上，自然干燥后， 用 0 丙
13、酮固定 0 15 分钟 ,于- 0保存备用。、盖片在去离子水中湿润后置架上滴加 1 20ul 杂交瘤上清或其她待检样品 ;设立阳性、阴性对照 ;置 3水浴孵育、 5-小时。c、取出盖片置P S 中用磁力搅拌器洗涤15 分钟。 d、盖片置架上，滴加工作浓度得抗鼠Ig 得荧光抗体10 20ul,37 孵育 0、 1 小时。 e、同法洗涤 15 分钟 ;取出盖片 ,用延缓荧光碎灭得封载剂 (如缓冲甘油， 9 份甘油加 1 份 PBS)封于干净载玻片上。 f、光显微镜上观察， 阳性结果可见特异性荧光 (FI C 为黄绿色荧光， ITC 为桔红色荧光 ) 。 g、细胞固定片得制备 ,也可改在培养板孔中进
14、行，其余步骤同上 ,在观察结果时 ,将培养板翻转置于荧光显微镜下 ,判断标准不变。细胞得膜荧光染色完整得活细胞得细胞膜 ,抗体不能透过。如果细胞在 4操作，则荧光染色仅限于细胞膜。必须注意死细胞常以非特异性方式吸附大量荧光抗体，因此试验过程中要保证细胞得高活力。活细胞得膜荧光染色大致步骤如下:a、制备活性较好得细胞悬液,调节浓度至1 7个 /ml. 、在小试管（5 50m)中加入10ul细胞悬液,再加入100ul待检 M Ab 得样品 ,混匀 ,4作用 30 9分钟。 c、用洗涤液 (P 900ml ，小牛血清 0 l， 4%NaN3 0m )洗二次,每次加洗涤液 1-5m , 000/离心分
15、钟 ,弃上清。加入 10 l 荧光抗体 ,4作用 0分钟 .d、同法洗涤，将细胞重新悬于 2 3 ul 含 0%甘油与 1 -0ug 苯二胺 /ml 得溶液中；滴加于载玻片上,加盖片封载。、立即在荧光显微镜上检查。f 、细胞也可在染色后用1%多聚甲醛生理盐水固定,立即检查 ,或至少在4可保存一周。(3）间接血凝试验间接血凝试验又称被动血凝试验(PH ),就是目前应用较广得检测方法之一.本试验就是以包被可溶性抗原得红细胞作为指示系统，当被检抗体与包被在红细胞上得抗原产生特异性反应时，导致红细胞呈凝集现象.可见 ,该法具有灵敏、快速、容易操作与无需昂贵仪器等优点，而且经改用醛化红细胞以后，克服原来
16、重复性差得缺点。器材与试剂、绵羊抗凝血，或人“O”型抗凝血。 b、缓冲液 :PBS（ H7 、 2);醋酸缓冲液。 c、甲醛 ,丙酮醛 ,NaN ,抗凝剂等。d、血凝板 ,振荡器等。 多糖抗原得间接血凝试验 a、甲醛化绵羊红细胞得制备 :无菌采集绵羊颈静脉血 0ml ，用枸橼酸钠作抗凝剂 ;用倍于红细胞压积得 P 7、 PBS( a2O4 H O 3、 8g,KH2P 4 0、4 g，N Cl8、01g,蒸馏水 000ml ）充分洗涤 5 次 ,每次 50rmin 1分钟 ,直至上清测定无蛋白质（用饱与硫酸铵滴定上清，观察有无白色沉淀 ),再以相同缓冲液配成 5%红细胞悬液 ;将25%红细胞悬
17、液与 0甲醛以、： 1 得比例混匀 , 7水浴作用 2 小时，每 15 分钟振荡一次，红细胞颜色逐渐由鲜红色转变为棕色;以 P 7、2 PBS 洗涤 4 次 ,每次 000mn 10 分钟 ,再以同样得P制成 2%红细胞悬液；其后 ,重复醛化一次 ,方法同前 ;最后配成 20%醛化绵羊红细胞悬液，加甲醛至0、 %防腐，保存备用。b、脂多糖抗原致敏甲醛化绵羊红细胞得制备 :取脂多糖 (L S),以、 2m/ PH8、 0 B 液，调整多糖浓度至 0 g/ l,然后100水浴处理 1 小时 ;将冷却至 7得热处理 P与 6%醛化红细胞等量混合,37搅拌作用45 分钟；取出离心 000r m 1分钟
18、 ,以 0、01 o PH7、2 PBS 洗涤次；配制成 4%致敏血球 ,分装 ,保存于 4备用 ,或冻干保存。 c、cA 得筛选 :取待测 cAb 样品 25 l, 加入型微量血凝板孔中 ,同时设立阴性、阳性对照 ;再加入 0、 5-%致敏红血球悬液 2 ul, 在振荡器上混匀 3秒；置室温或 37 0-60 分钟观察结果。 阴性对照孔应呈紧缩得圆点 .可溶性蛋白抗原得间接血凝试验 a、红细胞醛化 :采用双醛法。采绵羊或人“O”型抗凝血，每次加 10 倍于红细胞压积得 BS 洗涤 4次 ,然后配成 8%红细胞悬液；向此 8红细胞悬液缓慢加入等量含有 3% 丙酮醛与 3%甲醛得 PBS，于室温
19、缓慢搅拌小时；其后洗涤 3 次 ,配成 20%双醛化红细胞悬液， 加、 NaN3 防腐， 4保存备用。、致敏红细胞：取 20% 双醛化红细胞 0、1ml ，1 0r min 1 分钟 ,弃上清 ,沉积红细胞加 0、2mol L PH4、0 醋酸醋酸钠缓冲液 m，并加最适浓度 (应预先测定 ,蛋白抗原为 5 ug/ml 左右）得抗原 m ,混匀 ,于 45致敏 0 分钟 ,有时轻轻摇动，使红细胞不下沉。然后离心去上清 ,并用 20 倍于红细胞压积得 PBS 洗 4 次 ,最后用 PB配成、 5 %致敏红细胞 ,4保存备用。、 M Ab 测定：同上法。 （ 4)放射免疫测定放射免疫测定就是用放射性
20、同位素标记抗原或抗体 ,以检测相应抗原或抗体得定量方法。 在筛选与鉴定单抗时常用抗原固相法 ,即用抗原包被聚乙烯微板,借以检测样品中得M Ab, 其操作步骤如下 :a、用碳酸盐缓冲液将抗原稀释至适宜得浓度(1 1 0ug/ l），滴加聚乙烯微板孔内 ,100ul 孔 ,4过夜或 37 小时。 b、弃去抗原液 ,每孔加 100ul 含、 5 1% BSA 得PBS,4 1-2 小时封闭。 c、用 SAP S 洗涤次 ,每次 3 分钟 .、加待检样品 ,每孔 100ul, 设立阴性孔、 阳性孔与空白孔； 7 1-2 小时 ,同法洗涤。 e、每孔加 125I 标记得抗鼠g 抗体工作液100ul,3 1-2 小时 ,同法洗涤。 、用射线闪烁计数仪分别测定各孔放射性.通常要求样品孔与阳性对照孔得放射性脉冲分别超过本底5 倍与 10 倍。若以空白孔得放射性为基准,凡样品孔与阴性孔放射性之比大于得样品定为阳性 .