志贺氏菌检测.docx

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1、志贺氏菌检测1 设备与材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其她设备与材料如下：1、1 恒温培养箱 :36 1；1、2 冰箱： 2 ;1、3 膜过滤系统；1、4 厌氧培养装置： 4、 ;1、5电子天平：感量 0。1g；、 6显微镜 :0100;1、 均质器；、振荡器 ;1、9 无菌吸管 :1ml （具 0、 ml 刻度 )、10m（具 0、1l 刻度 )或微量移液器及吸头；1、1无菌均质杯或无菌均质袋：容量0ml ；、 11无菌培养皿 :直径 0mm；1、1计或 p比色管或精密 p试纸 ;1、 3全自动微生物生化鉴定系统。2 培养基与试剂3、志贺氏菌增菌肉汤 新生霉素：见附录中。3、 麦康凯

2、 (MAC ）琼脂：见附录中 2.3、3 木糖赖氨酸脱氧胆酸盐 (XLD) 琼脂：见附录中 3。3、4 三糖铁（ TSI）琼脂 :见附录中 4。3、5 营养琼脂斜面：见附录中5。3、6 半固体琼脂 :见附录中 63、7 葡萄糖铵培养基：见附录中7。3、8尿素琼脂：见附录中 8。3、9 半乳糖苷酶培养基 :见附录中 9。、 10氨基酸脱羧酶试验培养基:见附录中。、 11 糖发酵管 :见附录中 11。3、 2西蒙氏柠檬酸盐培养基 :见附录中 12.3、1粘液酸盐培养基 :见附录中 3。、 14蛋白胨水、靛基质试剂：见附录中 14。3、15 志贺氏菌属诊断血清 .3、 6 生化鉴定试剂盒。4 操作步

3、骤4、1 增菌以无菌操作取检样 25g(ml）,加入装有灭菌 25m志贺氏菌增菌肉汤得均质杯 ,用旋转刀片式均质器以 8 0 mn10000r/ in均质 ;或加入装有 225志贺氏菌增菌肉汤得均质袋中，用拍击式均质器连续均质 1i 2min，液体样品振荡混匀即可。于 1、，厌氧培养 16h20h。、 分离取增菌后得志贺氏增菌液分别划线接种于 XLD 琼脂平板与 MA 琼脂平板或志贺氏菌显色培养基平板上， 于 36 1培养 h24h，观察各个平板上生长得菌落形态。宋内氏志贺氏菌得单个菌落直径大于其她志贺氏菌 .若出现得菌落不典型或菌落较小不易观察 ,则继续培养至 48h再进行观察。志贺氏菌在不

4、同选择性琼脂平板上得菌落特征见表 1.表 1 志贺氏菌在不同选择性琼脂平板上得菌落特征选择性琼脂平板志贺氏菌得菌落特征MAC 琼脂无色至浅粉红色，半透明、光滑、湿润、圆形、边缘整齐或不齐 LD 琼脂粉红色至无色,半透明、光滑、湿润、圆形、边缘整齐或不齐4、3初步生化试验4。3.1 自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落 ,分别接种 I、半固体与营养琼脂斜面各一管，置36 1培养 0 4h,分别观察结果。 3。2 凡就是三糖铁琼脂中斜面产碱、底层产酸(发酵葡萄糖 ,不发酵乳糖 ,蔗糖）、不产气 (福氏志贺氏菌 6型可产生少量气体）、不产硫化氢、半固体管中无动力得菌株 ,挑取其、 3、

5、1中已培养得营养琼脂斜面上生长得菌苔，进行生化试验与血清学分型。4、 生化试验及附加生化试验 .4.1 生化试验用 .3中已培养得营养琼脂斜面上生长得菌苔 ,进行生化试验 ,即 半乳糖苷酶、尿素、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶以及水杨苷与七叶苷得分解试验。除宋内氏志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌 1型得鸟氨酸阳性；宋内氏菌与痢疾志贺氏菌 1型，鲍氏志贺氏菌 13型得 半乳糖苷酶为阳性以外 ,其余生化试验志贺氏菌属得培养物均为阴性结果。另外由于福氏志贺氏菌 6型得生化特性与痢疾志贺氏菌或鲍氏志贺氏菌相似 ,必要时还需加做靛基质、甘露醇、棉子糖、甘油试验 ,也可做革兰氏染色检查与氧化酶试验 ,应为氧化酶阴性得革

6、兰氏阴性杆菌。生化反应不符合得菌株， 即使能与某种志贺氏菌分型血清发生凝集， 仍不得判定为志贺氏菌属。志贺氏菌属生化特性见表 2。表2志贺氏菌属四个群得生化特征生化反应群 :痢疾志贺氏菌B群 :福氏志贺氏菌C群：鲍氏志贺氏菌D群 :宋内氏志贺氏菌 -半乳糖苷酶 a-尿素-赖氨酸脱羧酶-鸟氨酸脱羧酶-b水样苷-七叶苷-靛基质- +(+)-/+-甘露醇-+c+棉子糖甘油（ +）（ +)注 :+表示阳性；表示阴性 ; /表示多数阴性 ;+/ 表示多数阳性；（ +）表示迟缓阳性； d表示有不同生化型。a 痢疾志贺 1型与鲍氏 13型为阳性。b 鲍氏 13型为鸟氨酸阳性。c 福氏型与型常见甘露醇阴性变种

7、。44。 附加生化实验由于某些不活泼得大肠埃希氏菌(ana rogenic E、 ol)、 A D(Alk lescens-D isparboyes碱性异型）菌得部分生化特征与志贺氏菌相似，并能与某种志贺氏菌分型血清发生凝集;因此前面生化实验符合志贺氏菌属生化特性得培养物还需另加葡萄糖胺、 西蒙氏柠檬酸盐、粘液酸盐试验 (36培养 244h).志贺氏菌属与不活泼大肠埃希氏菌、 A 菌得生化特性区别见表 3.表3志贺氏菌属与不活泼大肠埃希氏菌、A D 菌得生化特性区别生化反应A 群 :痢疾群：福氏C群 :鲍氏D群 :宋内氏大肠埃希A- 菌志贺氏菌志贺氏菌志贺氏菌志贺氏菌氏菌葡萄糖胺-+西蒙氏柠檬

8、酸盐-dd粘液酸盐-d+d注 :+ 表示阳性；表示阴性；表示有不同生化型。注 2:在葡萄糖铵、西蒙氏柠檬酸盐、粘液酸盐试验三项反应中志贺氏菌一般为阴性，而不活泼得大肠埃希氏菌、 A （碱性 异型 )菌至少有一项反应为阳性。4.4。 如选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统,可根据 4、得初步判断结果，用 4、中已培养得营养琼脂斜面上生长得菌苔,使用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统进行鉴定。4、5 血清学鉴定。 1抗原得准备志贺氏菌属没有动力 ,所以没有鞭毛抗原志贺氏菌属主要有菌体( )抗原。菌体 O抗原又可分为型与群得特异性抗原。一般采用、 2%、 5%琼脂培养物作为玻片凝集试验

9、用得抗原。注 1:一些志贺氏菌如果因为 K 抗原得存在而不出现凝集反应时 ,可挑取菌苔于 1ml生理盐水做成浓菌液 ,1 0煮沸 15mn60m去除抗原后再检查。注 2：群志贺氏菌既可能就是光滑型菌株也可能就是粗糙型菌株,与其她志贺氏菌群抗原不存在交叉反应 .与肠杆菌科不同 ,宋内氏志贺氏菌粗糙型菌株不一定会自凝 .宋内氏志贺氏菌没有 K 抗原。4.5.凝集反应在玻片上划出 2个约 cm cm得区域，挑取一环待测菌，各放 1/环于玻片上得每一区域上部 ,在其中一个区域下部加 1滴抗血清 ,在另一区域下部加入 1滴生理盐水 ,作为对照。再用无菌得接种环或针分别将两个区域内得菌落研成乳状液。将玻片

10、倾斜摇动混合1min，并对着黑色背景进行观察,如果抗血清中出现凝结成块得颗粒，而且生理盐水中没有发生自凝现象，那么凝集反应为阳性。如果生理盐水中出现凝集 ,视作为自凝。这时，应挑取同一培养基上得其她菌落继续进行试验。如果待测菌得生化特征符合志贺氏菌属生化特征，而其血清学试验为阴性得话 ,则按 4。 1 注 1进行试验。附录 培养基与试剂1 志贺氏菌增菌汤 -新生霉素 (Shigel broth) 1、1 志贺氏菌增菌肉汤1.1。1成分胰蛋白胨?20、 g葡萄糖?、 0g磷酸氢二钾?2、 g磷酸二氢钾? 2、0g氯化钠 ?5、吐温 8?、 5ml蒸馏水 ?1000mpH? ?7、1.1.制法将以

11、上成分混合加热溶解,冷却至 25左右校正 pH,分装适当得容器 ,121灭菌 1 in,取出后冷却至 5055，加入除菌过滤得新生霉素溶液（、5 g/ l）,分装 225m备用。注：如不立即使用 ,在2 8条件下可储存一个月。1、 新生霉素溶液。 2.1成分新生霉素 ?25、0mg蒸馏水 ?100 l1。22 制法将新生霉素溶解于蒸馏水中,用 0、 2过滤膜除菌， 如不立即使用 ,在28条件下可储存一个月。、3 临用时每 225l 志贺氏菌增菌肉汤 (、1)加入新生霉素溶液(1、2）,混匀。 2 麦康凯 (MAC ）琼脂2、1 成分蛋白胨 ?20、0g乳糖 ?10、0g3号胆盐 ? ?1 5g

12、氯化钠?5、0g中性红?0、03g结晶紫? 0、00 g琼脂?15、0g蒸馏水 ?1000mlpH、 2 0、2、制法将以上成分混合加热溶解，冷却至25左右校正 p,分装， 121高压灭菌15mn。冷却至 4550，倾注平板 .注：如不立即使用 ,在2 8条件下可储存二周 .3 木糖赖氨酸脱氧胆盐（ XL )琼脂3、 成分酵母膏? ?3、 0L 赖氨酸? ? 5。0g木糖 ?3、 5g乳糖 ?7、蔗糖 ? ?、 5g脱氧胆酸钠? 1、0g氯化钠 ?5、 0硫代硫酸钠 ?6、 8g柠檬酸铁铵 ?、 8g酚红?、 08g琼脂? ?15、 0g蒸馏水 ?10 ml ? 7、 4 0、2、 2 制法除

13、酚红与琼脂外 ,将其她成分加入 400ml蒸馏水中，煮沸溶解 ,校正 pH 。另将琼脂加入 60蒸馏水中，煮沸溶解。将上述两溶液混合均匀后,再加入指示剂 ,待冷至0 55倾注平皿。注：本培养基不需要高压灭菌,在制备过程中不宜过分加热，避免降低其选择性，贮于室温暗处.本培养基宜于当天制备，第二天使用。使用前必须去除平板表面上得水珠，在 37 55温度下，琼脂面向下、平板盖亦向下烘干。另外如配置好得培养基不立即使用，在2 8条件下可储存二周 .4 三塘铁 (TSI) 琼脂、 成分蛋白胨 ? ?20、 g牛肉浸膏 ? ?5、 0g乳糖?10、0g蔗糖 ? ?10、0g葡萄糖 ?1、0g硫酸亚铁铵 (

14、NH 42（ ) H2O、) FS0g氯化钠 ?5、 g硫代硫酸钠?0、 2g酚红? 0、025g琼脂?1、蒸馏水 ? ?10 0mlpH? ? 7、 4 0、 24、2 制法除酚红与琼脂外，将其她成分加于400ml蒸馏水中 ,搅拌均匀，静置约 10m ,加热使完全溶化， 冷却至 25左右校正 pH至7、 0、2.另将琼脂加于 6 0ml蒸馏水中 ,静置约 10min,加热使完全溶化。将两溶液混合均匀 ,加入 5%酚红水溶液 5ml, 混匀，分装小号试管 ,每管约 3m。于 121灭菌 15 n,制成高层斜面。冷却后呈桔红色。如不立即使用 ,在条件下可储存一个月。 营养琼脂斜面5、1 成分蛋白

15、胨 ? ?10、0牛肉膏?3、 0g氯化钠? 5、琼脂 ?5、0g蒸馏水 ? 00 l H ? ? 7、 0 0、 25、2 制法将除琼脂以外得各成分溶解于蒸馏水内,加入 15%氢氧化钠溶液约 2ml，冷却至 25左右校正 pH至7、00、2。加入琼脂，加热煮沸，使琼脂溶化。分装小号试管 ,每管约 .于 1灭菌 15m ,制成斜面。注 :如不立即使用 ,在2条件下可储存二周6 半固体琼脂6、1 成分蛋白胨 ? ?1、0g牛肉膏? ?、 3g氯化钠?、 5g琼脂 ?0、 g0、7g蒸馏水? ?100m H? ? ?7、 4 0、 2 6、2 制法按以上成分配好 ,加热溶解 ,校正 pH，分装小试

16、管 , 21灭菌 15in ，直立凝固备用 .7 葡萄糖胺培养基7、1 成分氯化钠?5、0g硫酸镁 (Mg O4 7 2O)?0、 2g磷酸二氢铵 ?1、0磷酸氢二钾 ? ?、 0葡萄弹?2、0琼脂?20、 0g0、2溴麝香草酚蓝水溶液?40、0ml蒸馏水 ?1 0pH?6、 8、7、2 制法先将盐类与糖溶解于水内,校正 pH，再加入琼脂加热溶解 ,然后加入指示剂。混合均匀后分装试管 ,121高压灭菌 5in。制成斜面备用8 尿素琼脂8、1 成分蛋白胨?1、 g氯化钠?、 0g葡萄糖?1、 0磷酸二氢钾?2、0、 %酚红溶液 ?3、 0ml琼脂? 2、 g 0尿素溶液 ? ?10、 0蒸馏水

17、? ?100pH ?、 20、将上述成分加入蒸馏水中,煮沸溶解，调节 p,分装小试管， 121高压灭菌 15m n。、 2 制法除酚红与尿素外得其她成分加热溶解，冷却至 25左右校正 pH，加入酚红指示剂，混匀，于 121灭菌 15mn.冷至约 55,加入用 0、22 m过滤膜除菌后得 20尿素水溶液 1 0ml,混匀 ,以无菌操作分装灭菌试管 ,每管约 ml ml,制成斜面后放冰箱备用。8、3试验方法挑取琼脂培养物接种 ,在 36培养 4h,观察结果。尿素酶阳性者由于产碱而使培养基变为红色。9 半乳糖苷酶培养基9、1 液体法 (ONPG法）。 1.1 成分邻硝基苯 -D- 半乳糖苷 (ONP

18、G)60?、 mg0、0m l/L 磷酸钠缓冲液 (p7、 0、） 、 0 l1蛋白胨水 (pH7、50、2)?3、 0ml9。1。 制法将ONPG溶于缓冲液内 ,加入蛋白胨水，以过滤法除菌 ,分装于 10mmm试管内，每管、 m,用橡皮塞塞紧。9.1.3 试验方法自琼脂斜面挑取培养物一满环接种， 于 361培养 h3h与24h观察结果。如半乳糖苷酶产生,则于 13h变黄色 , 如无此酶则 24h不变色。9、2 平板法（ X al法 )。 2。成分蛋白胨 ?0、 g氯化钠 ?、 05-溴 4氯 -3吲哚 -半乳糖苷（ X G )200、 0 g琼脂 ? ?15、 g蒸馏水 ? ? 00mlpH

19、?、 0、 2 .2.2 制法将各成分加热煮沸于 1L水中，冷却至 25左右校正 p， 115高压灭菌0min。倾注平板避光冷藏备用。9.2.3 试验方法挑取琼脂斜面培养物接种于平板,划线与点种均可 ,于 6 1培养 1h 4h观察结果。如果 -D- 半乳糖苷酶产生，则平板上培养物颜色变蓝色 ,如无此酶则培养物为无色或不透明色 ,培养 48h7h后有部分转为淡粉红色10 氨基酸脱羧酶试验培养基10、1 成分蛋白胨? ?5、0g酵母浸膏?3、0g葡萄糖?1、 g1、6%溴甲酚紫乙醇溶液?1、0mlL 型或 DL 型赖氨酸与鸟氨酸 0?。5g 1 m或。 0/100蒸馏水? 000mlpH?6、8

20、0、 0、 制法除氨基酸以外得成分加热溶解后，分装每瓶 0ml, 分别加入赖氨酸与鸟氨酸。 L- 氨基酸按 0、加入 ,DL- 氨基酸按 1%加入 ,再校正 pH至6、8、 2。对照培养基不加氨基酸。 分装于灭菌得小试管内 ,每管 0、5 l,上面滴加一层石蜡油，1高压灭菌 0m。 0、 3 试验方法从琼脂斜面上挑取培养物接种，于6 1培养 h24h，观察结果。氨基酸脱羧酶阳性者由于产碱，培养基应呈紫色。阴性者无碱性产物 ,但因葡萄糖产酸而使培养基变为黄色。阴性对照管应为黄色，空白对照管为紫色。11 糖发酵管11、1 成分牛肉膏?5、0g蛋白胨 ?10、 0g氯化钠 ?、 0g磷酸氢二钠 (N

21、a2HPO4 H2 O)?、 0g0、溴麝香草酚蓝溶液?12、0m蒸馏水?100lpH ?、 4、 211、2 制法。 2葡萄糖发酵管按上述成分配好后，按0、5%加入葡萄糖 ,5左右校正 pH,分装于有一个倒置小管得小试管内，1 1高压灭菌 1 in.。 2。2 其她各种糖发酵管可按上述成分配好后 ,分装每瓶 1 0ml，1高压灭菌 15min。另将各种糖类分别配好 10%溶液 ,同时高压灭菌。将 5ml糖溶液加入于 100ml培养基内 ,以无菌操作分装小试管 .注：蔗糖不纯，加热后会自行水解者,应采用过滤法除菌。1、 3 试验方法从琼脂斜面上挑取小量培养物接种,于36培养，一般 2 3迟缓反

22、应需观察 4 d。12 西蒙氏柠檬酸盐培养基1、 1 成分氯化钠 ?5、 g硫酸镁（ MgSO H2） ?、 2g磷酸二氢铵 ?1、 g磷酸氢二钾 ?、 0柠檬酸钠?5、 0g琼脂?20g0、2%溴麝香草酚蓝溶液、 0m蒸馏水 ? 000mpH?6、 0、 212、2 制法先将盐类溶解于水内 ,调至 H,加入琼脂，加热溶化。然后加入指示剂 ,混合均匀后分装试管 ,2灭菌 5 in。制成斜面备用。12、3 试验方法挑取少量琼脂培养物接种,于3 1培养 4，每天观察结果。阳性者斜面上有菌落生长，培养基从绿色转为蓝色。13 粘液酸盐培养基13、1 测试肉汤13。 .1 成分酪蛋白胨?10、0溴麝香草

23、酚蓝溶液 ?0、 024g蒸馏水 ? ?1000ml粘液酸?10、0gpH? 7、40、213。1.2制法慢慢加入 5氢氧化钠以溶解粘液酸,混匀。其余成分加热溶解 ,加入上述粘液酸，冷却至 2左右校正 pH至,分装试管 ,每管约，于 21高压灭菌 10。1、 2 质控肉汤 3。 . 成分酪蛋白胨 ? ?、 0g溴麝香草酚蓝溶液 ?0、 4g蒸馏水?100p?7、 0、21 2.2 制法所有成分加热溶解，冷却至2左右校正 H，分装试管 ,每管约 5l,于121高压灭菌 0 n。13、3 试验方法将待测新鲜培养物接种测试肉汤与质控肉汤,于 6 1培养 8h观察结果 ,肉汤颜色蓝色不变则为阴性结果,

24、黄色或稻草黄色为阳性结果。14 蛋白胨水、靛基质试剂1、成分蛋白胨（或胰蛋白胨 )?20、0g氯化钠?、 0g蒸馏水 ?1000mLpH?、 4 4、 2制法按上述成分配制，分装小试管,121高压灭菌 15 min.注：此试剂在 2 8条件下可储存一个月 .、靛基质试剂14。3.1柯凡克试剂 :将 5g对二甲氨基苯甲醛溶解于75ml戊醇中 .然后缓慢加入浓盐酸 25ml。1。 3.2 欧-波试剂 :将1g对二甲氨基苯甲醛溶解于95 l9乙醇内然后缓慢加入浓盐酸 0ml. 4、 试验方法挑取少量培养物接种， 在 1培养 1d2,必要时可培养 45d加入柯凡克试剂约、 5ml，轻摇试管，阳性者于试剂层呈深红色；或加入欧波试剂约、 5ml，沿管壁流下 ,覆盖于培养液表面，阳性者于液面接触处呈玫瑰红色。注：蛋白胨中应含有丰富得色氨酸。每批蛋白胨买来后,应先用已知菌种鉴定后方可使用 ,此试剂在 2 8条件下可储存一个月。