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1、.真核细胞常见表达载体真核细胞 , 表达载体1、 pCMVp-NEO-BAN载体特点 :该真核细胞表达载体分子量为6600 碱基对，主要由CMVp 启动子、兔-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗 neo 基因以及 pBR322 骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo 基因存在，转染细胞后，用G418 筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。插入外源基因的克隆位点包括Sal1、 BamH1 和 EcoR1 位点。注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。2、 pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体 (Enhan
2、ced Fluorecent Protein Vector)特点 : pEGFP 表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV 启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的 SV40origin使该载体在任何表达 SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。Neo 抗性盒由 SV40 早期启动子、 Tn5 的 neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK 基因的聚腺嘌呤信号组成， 能应用 G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外， 载体中的 pUC origin能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin 抗性基因在大肠杆菌中的表达。用途 :
3、 该表达载体EGFP 上游有 Nde1、Eco47111 和 Age1 克隆位点， 将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP 的融合基因。借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。亦可用于检测克隆的启动子活性(取代 CMV 启动子 ,Acet1-Nhe1) 。3、 pEGFT-Actin,增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体特点 :pEGFP-Actin 表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆-肌动蛋白基因， 在 PCMV 启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40origin 使该载体在任何表达SV40T 抗原的真核细胞内进行复制。 Neo 抗性盒由 SV40
4、 早期启动子、 Tn5 的 neomycin/kanamycin 抗性基因以及 HSV-TK 基因的聚腺嘌呤信号组成， 能应用 G418 筛选稳定转染的真核细胞株。此外， 载体中的 pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin 抗性基因在大肠杆菌中的表达。用途 : pEGFP-Actin 载体在真核细胞表达EGFP-Actin 融合蛋白， 该蛋白能整合到胞内正在生的肌动蛋白，因而在活细胞和固定细胞中观察到细胞内含肌动蛋白的亚细胞结构。4、 pSV2 表达载体特点： 该表达质粒是以病责SV40 启动子驱动在真核细胞目的基因进行表达的
5、，克隆位点为Hind111 。SV40 启动子具有组织/细胞的选择特异性。此载体不含neo 基因，故不能用来筛选、建立稳定的表达细胞株。5、CMV4表达载体特点 :该真核细胞表达载体由CMV启动子驱动，多克隆区域酶切位点选择性较多。含有氨苄青霉素抗性基因和生长基因片段以及SV40复制原点和fl 单链复制原点。但值得注意的是，该表达载体不含有neo 基因，转染細胞后不能用G418 筛选稳定的表达细胞株。其他常用克隆Vector：pBluscript II KS DNA15 ugpUC18 DNA25 ugpUC19 DNA25 ug说明 :pBluescript II kS、 pUC18 &Pu
6、c19 载体适合于DNA 片段的克隆、 DNA 测序和对外源基因进行表达等。这些载体由于在lacZ 基因中含有多克隆位点，当外源DNA 片段扦入，转化lacZ 基因缺乏细胞，并在含有IPTG 和 X-gal 的培养基上培养时，含有外源DNA 载体的细胞.将为白色菌落，而无外源DNA 片段载体的细胞则为兰色菌落，由此易于筛选有无外源DNA 片段的载体。此外，这些载体中有便于测序的 M13 、T7 和 T3 的通用引物进行 DNA 测序。保存液 : TE BufferTE Buffer 组成 :10mM Tris.HCL(Ph 8.0)1mM EDTA用途 :克隆外源DNA 片断 .进行基因表达
7、.使用 M13 、T7 和 T3 引物进行测序.存在的问题细胞的生命活动是一个复杂的调控过程，有些生命活动的机理还不完全清晰，由于插人的目的基因不同，载体构建栗用的顺式组件不同，组装的空间位置不同，采用的表达系统不同，目的基因表达水平和阳性克隆筛选率都会有很大差异。另外，由于所有的顺式元件存在种属和组织特异性，所构建的高效表达载体不一定在所有细胞株中均高效表达。再者，细胞生长状态的差异，转染方法的不同培养时阉的长短，筛选药物浓度的高低，对表达量都有很大影响。所以，需要综合评价一个表达载体和表达系统，排除一些不定因素，筛选出最佳组合真核表达载体趋向于既有利于扩增目的基因又有利于筛选阳性克隆的载体
8、的构建。许多有效的应用范围广的强启动子和增强子被人发现并应用于载体中，大大提高了目的基因的表达量，另外一些强的组成型启动子，如SV40 早期启动子 +PHTLv ，已应用于大规模生产的细胞系中。应用以 GS 为筛选标志的表达载体可兼有筛选和扩增目的基因两种功能，是目前研究的重点。以IRES 连接的双顺反子表达载体已成为核表达载体的主体。在同一启动子操纵下，筛选基因或报告基因与目的基因转录在同一mRNA 上通过IRES 的作用，表达出两种蛋白，因而在理论上可认为，通过了筛选或表达了报告基因的克隆必为阳性克隆，即表达目的基因的克隆，有报道说这种双顺反子的共表达率为90。这就大大提高了筛选率，简化了实验过程。将强启动子、增强子和可扩增的筛选标志组装在同一载体上，构建高效表达和筛选的表达载体并将其运用于最合适的表达系统中，是当今真核表达载体构建研究发展方向。.