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1、地中海贫血的实验室检测 及临床应用,主要内容,地中海贫血的遗传学基础 地中海贫血的实验室检测及应用 少见型地中海贫血应用范例 技术服务简介,红细胞,血液中数量最多的一种红细胞 运送氧气功能 红细胞中含 有血红蛋白， 因而使血液呈红色 。 血红蛋白合成不足或不能合成， 引起贫血。,血红蛋白,成人血红蛋白HbA由两条 珠蛋白链和两条珠蛋白链 组成，每条肽链有一个包含 铁原子的环状血红素,血红蛋白病概念,由编码珠蛋白的基因突变引起珠蛋白肽链异常所致的疾病统称血红蛋白病。分为两种情况： 1、异常血红蛋白病：基因突变导致珠蛋白肽链结构发生改变。（珠蛋白的一级结构发生改变 的血红蛋白） 2、地中海贫血：基
2、因突变导致珠蛋白肽链合成量减少。 地中海贫血是血红蛋白病的重要类型之一,血红蛋白病的分类,地中海贫血概念,地中海贫血是由于珠蛋白基因的缺 失或缺 陷使某种蛋白链合成受到抑制而引起的溶血性贫血，为单基因遗传病。典型的常染色体隐性遗传病。 主要有两种类型：-地中海贫血 -地中海贫血,地中海贫血临床特征（中、重度）,小细胞低色素性溶血性贫血 黄疸 肝脾肿大（脾大明显） 骨髓增生 生长发育迟缓 合并感染 Barts水肿胎 输血依赖性,地中海贫血的遗传学基础,地中海贫血的遗传规律,人体不同发育时期的血红蛋白及其组成,人体不同发育时期的珠蛋白表达规律,蛋白链发育阶段特异性的临床意义,胎儿血红蛋白为22 所
3、以地贫的纯合子(基因不表达）,由于不能合成肽链，出现Hb Barts水肿胎,宫内发生严重贫血。 （孕妇可发生妊娠高血压综合征、巨大胎盘、产后出血等并发症） 胎儿期的链是低水平表达，以链表达为主，所以链的减少对胎儿期无影响，出生后头几个月链逐渐被链取代，故重型地贫一般在出生几个月才出现贫血。（贫血逐渐加重，肝脾大，反复输血和去铁治疗）,胎儿重型地贫和成人HbH病的病理生理学机制,中国南方和地贫的人群携带率,非缺失型地贫,广西地区5789例样本中异常血红蛋筛查结果 类型 携带率 WS 1.55% QS 0.36% CS 1.21%,和病理学机制和临床分类,主要内容,地中海贫血的遗传学基础 地中海贫
4、血的实验室检测及应用 少见型地中海贫血应用范例 技术服务简介,-地贫的概念,由于 珠蛋白基因缺失或点突变，使链 合成受到抑制而引起的贫血。 -基因缺陷 -链不足 -地贫 16p13 正常人共有4个基因 (每条16号染色体上有2个) 正常人共有4个基因 (每条16号染色体上有2个) 有4个基因 (每条16号染色体上有2个),地贫分子基础,有两种分子机制引起地贫： 缺失型地贫，占地贫的95%以上，由基因缺失引起。 非缺失型地贫，占地贫约5%，由基因点突变引起。,17种引起珠蛋白表达降低的常见缺 失突变,中国南方人群12种非缺失型地中海贫血的突变谱,-地贫的分类,静止型地贫 轻型地贫 HbH病 Hb
5、 Barts 巴氏胎儿水肿综合症,静止型地贫,基因型：一个-珠蛋白基因缺失或突变。 表示为：-/或T/ (T表示突变型） 临床表现：无症状，血常规正常 Hb电泳分析： 新生儿：Hb Barts 0.5%1%。 成 人：Hb电泳难以检出,静止型地贫,地贫筛查常发现不了，需要作基因检测， 但若和0地中海贫血杂合子通婚后则有 可能生育较严重的HbH病患儿。 常见有：-3.7/、-4.2/ 、WS/,轻型地贫,基因型：2个-珠蛋白基因缺失 或每条染色体上各有一个 基因缺失或缺陷 表示为：- -/或 -/- 或-/T 临床表现：无明显症状；红细胞脆性降低（60%）； MCV80fl；MCH27pg；Hb
6、正常或轻度下降 亨氏小体可能阳性 血象：小细胞低色素性贫血 Hb电泳分析： 新生儿：Hb Barts 1%10% 成年人：HbA2 2.5%,HbH病,基因型：3个-珠蛋白基因缺失或突变 表示为： - -/-（- -/T） 临床表现： 链的合成受到严重影响，大量的-珠蛋白链过剩 而聚合为四聚体HbH（4），使红细胞受损，导致 慢性溶血性贫血。 有轻度或中度贫血，部分患者伴肝脾肿大及轻度黄 疸，较重者亦需输血治疗。感染和服用氧化性药物及妊 娠均可使贫血加重。,HbH病,2类HbH病的血液学参数比较,地贫疾病严重程度的单倍型顺序,2约占基因表达量的2/3,1基因占1/3,Hb Barts 胎儿水肿
7、综合征,基因型：四个-珠蛋白基因缺失或突变 表示为：- -/- - 临床表现： 链不能合成，链聚合成 Hb Barts (4)，氧亲和力高，造成 组织缺氧坏死，导致早产、死胎，个别能活到足月，也会于出生 几小时内死亡。 胎儿有苍白、水肿、肝脾肿大，胸腹腔积液，大胎盘。孕妇容 易合并妊娠高血压综合征及产后出血等并发症。 Hb电泳分析： Hb Barts 7080% Hb portland（ 2 2 ） 725% Hb A 0 Hb F 0,胎儿水肿（一）,胎儿水肿（二）,中国人常见的缺失型地贫,0地贫：一条染色体上缺失两个连锁的基因，即1和2 基 因都缺失，如- -SEA/ ，又称东南亚缺失型;
8、 - -THAI / , 又称泰国型 缺失。 +地贫：是一条染色体上缺失1个基因（1或2），分两种： -3.7（右侧缺失）：缺失2的3端和1的5端，缺失片段约 3.7kb。 -4.2 （左侧缺失）：2 基因完全缺失，1 基因完整，缺失 片段为4.2kb。 由于2基因的表达水平占整个基因表达量的70%左右，理论上 左缺失型比右缺失型对基因表达的影响大。,实验室检测诊断技术,筛查+基因检测： 1、血细胞自动分析技术：获取数据：RBC、HGB，MCV MCH等数据。 2、血红蛋白分析：获取数据：HbA、HbA2、HbF以及一些异常血红蛋白 3、Gap-PCR：获取数据：缺失型、缺失型 4、反向点杂交
9、（RDB)）：非缺失型、, 缺失型地贫的诊断（Gap-PCR法） 益生堂,检测中国人群常见4 种-地中海贫血缺失型：-SEA ，-3.7，-a4.2 和- -THAI ； 国内唯一获得CFDA批准检测泰国型缺失的试剂，扩大了检测范围，减少漏诊风险;。 可用于抗凝外周血样本、羊水样本或胎绒毛样本等。灵敏度高。 单管多重PCR，检测流程简便、快速，结果准确、可靠。,Gap-PCR检测缺失型地中海贫血基因,非缺失型的诊断（PCR探针法）益生堂,检测中国人群中常见的3种2 基因点突变: CS 、 QS、 WS 检测非缺失型和地贫基因时各项控制参数相同，可同机扩增、同管杂交、洗涤、显色 杂交时间灵活（可
10、杂交2-18小时），便于合理安排实验时间,非缺失型地贫基因检测 （RDB法）,3种非缺失型地贫突变位点 ( WS ,CACCAG; QS,CTGCCG; CS ,TAACAA),地贫的遗传咨询（一）,地贫的遗传咨询（二）,地贫的遗传咨询（三）,地贫产前诊断指征（一）,夫妇双方都携带-SEA / 夫妇双方都携带-THAI / 夫妇一方为-SEA / 另一方为-THAI / 有1/4的机会生育Hb Barts 水肿胎，需要产前诊断。,地贫产前诊断指征（二）,一方为-SEA / 或-THAI / ,其配偶为T非缺失型 突变（突变型为CS、QS）,需要产前诊断。,地贫诊断小结,首先夫妇双方做地贫筛查（
11、血常规+Hb分析） 筛查提示 -地贫时，双方做 -基因检查（注意同时 检查缺失及非缺失 基因）若基因结果出现 -地贫产 前诊断指征，需要做产前诊断 根据具体情况选择产前诊断方法 胎儿为HbBarts水肿胎时，建议终止妊娠；为HbH病 时，根据病人意愿处理,地贫分子基础,大部分基因点突变和少部基因缺失,地贫的概念,由于珠蛋白基因的突变，引起血红蛋白链合成的减少 或缺乏而形成的溶血性贫血。 -基因缺陷 链不足 地贫 基因在11号染色体上（11p15），每条染色体上有1个 基因。,珠蛋白基因突变及其对基因功能的影响,0 : 珠蛋白链不能合成 + : 珠蛋白链合成减少,中国南方人群46种地贫点突变谱及
12、其功能影响,珠蛋白基因突变及其对基因功能的影响,地贫常见的基因缺失突变,地贫病临床表现及分型,地贫病临床表现及分型,注：根据人体不同发育时期的血红蛋白及其组成， 胎儿发育直至出生时基因低水平表达，导致地 中海贫血的突变对基因的抑制作用在出生时难以 显示，因此重型地贫患儿出生时不会表现出疾病 类型。出生后几个月发病（1周岁内） 基因确诊！,地贫基因型与表型的关系,夫妇双方均为地贫携带者（0或+）， 有1/4的机会生育中、重型患儿。,地贫的实验室检测,1、筛查： 筛查指标（与前述 -地贫一样）：血常规+Hb分析 仪器：红细胞计数仪、Hb电泳仪或高效液相分析仪 筛查阳性： MCV80 fL，MCH
13、3.5% HbA2升高对判断-地贫至关重要，几乎可筛 查出所有-地贫基因携带者。,地贫的实验室检测,2、地贫的基因检测 PCR- RDB法 注意：大部分所用基因检测方法只检测常见的 17个基因点突变，不能检查少见或罕见的点 突变。当检测阴性时，应结合HbA2值判断。,地中海贫血基因检测试剂盒（PCR探针法） （益生堂）,起始样本为抗凝人全血，羊水或胎绒毛。 检测高通量，一份标本只需做一管PCR即可鉴别临床意义重大的17种点突变。全过程大约6-8小时。 寡核苷酸探针杂交，特异性高，操作简便，重复性、稳定性良好 易于推广应用，凡能开展PCR实验的单位(有PCR仪和分子杂交炉/恒温水浴摇床)均能采用
14、本试剂盒。 与非缺失-地中海贫血基因检测试剂盒扩增条件相同。采用相 同的扩增和杂交参数，一台PCR 仪同时扩增，同管杂交，且同一 份杂交物可经过1-2次的重新杂交，可进行结果的复核与验证。,检测原理(PCR-RDB用于检测和点突变),重型地贫：0突变双重杂合子,地贫复合地贫,指同时携带有地贫和地贫，因为是不同类型 的地贫，患者一般无症状。 地贫筛查的表现同地贫（MCV, Hb A2）， 因此无法与单纯的地贫区别开。检查地贫携带 者的地贫基因是唯一的区别方法。,地贫复合地贫,因此，当夫妇双方的一方是地贫，另一方是地 贫时，地贫携带者应检查地贫基因。若是地 贫复合 地贫，则根据情况产前诊断。,地贫
15、复合地贫示例,地贫复合地贫示例,基因诊断方法,Gap-PCR技术，缺失型-地中海贫血基因检测的首选方法 PCR-探针法(RDB)技术，-地中海贫血突变基因检测、非缺失型-地中海贫血突变基因检测的首选方法 MLPA (缺失型、分子诊断技术） DHPLC（地中海贫血突变分析 ） DNA序列测定法（direct sequencing,DS）基因突变检测方法的金标准 高分辨熔解曲线分析系统（HRM或HRMA）:DNA序列突变的检测,主要内容,地中海贫血的遗传学基础 地中海贫血的实验室检测及应用 少见型地中海贫血应用范例 技术服务简介,少见型地贫基因检测指征及流程,示例 一：地贫的基因诊断（基因测序）,
16、试剂盒检测范围只包括17个基因点突变，不能 检测少见或罕见的点突变，当检测到阴性时，应 结合HbA2值综合判断。,地贫的基因诊断 (基因测序）,7195测序结果： 在nt397处出现双峰，GA，对应于CD37(TGGTAG)，已知文献报道与-地贫有关。,示例一中地贫的基因诊断 (基因测序）,示例二：地贫的基因诊断（基因测序）,2015年11月深圳市 医院， 1 孕妇遗传咨询 父亲 41-42M杂合子 母亲 未检出17种突变 先证者 （？岁）夫妻俩第一个孩子 检出 41-42M杂合子 但每月需定期输血！ 母亲可能 存在试剂盒检测范围外的突变，先证者、母亲均进行测序 母亲：CD8-9(+G)突变，
17、已知文献报道与-地贫有关 先证者： CD8-9(+G)和CD41-42（ -TCTT ）突变 胎儿：未检出突变（测序结果有效范围：珠蛋白基因-90至IVS-2-100、IVS-2-500至3，Poly A部分，包含了地中海贫血预防控制操作指南中报道的46种中国南方人群-地中海贫血突变位点及在此区域内的未知突变位点。）,示例二中先证者测序图,示例二中先证者测序图,示例三：地贫基因检测（缺失型 ）,父亲： -SEA / 27-28M/27-28M 母亲： -SEA / N/ N 胎儿(脐血）： / N/ N 小孩未遗传到父亲的27-28M位点突变，不符合遗传规律 父亲是否有缺失（无筛查指标）,示例
18、三：地贫基因检测（缺失型 ）,示例四：少见缺失,女，39岁，福建永泰人，汉族，2015年4月 进行孕期检查。查体：贫血面容。HGB 96 gL、 (MCV)52.4 fl、(MCH)15.2 Pg、Hb A2 1.5， 常规地贫基因检测检出东南亚型地贫缺失片段 (-SEA/-SEA)，提示怀疑存在其他缺失片段。 确认基因型：-27.6/-SEA,问题一：MCV低一定是地贫吗,问题二：血红蛋白异常一定是地贫吗,问题三,问题四,问题五：什么情况下需要作地贫的产前诊断,双方为同一种地贫携带者 怀孕或分娩过巴氏水肿胎 分娩过重度地贫患儿 夫妇双方之一为地贫基因携带者，另一方为合并地贫基因携带者,主要内
19、容,地中海贫血的遗传学基础 地中海贫血的实验室检测及应用 少见型地中海贫血应用范例 技术服务简介,少见型地中海贫血基因检测服务（一）益生堂,缺失型地贫： -2.4 、-27.6 、 -21.9 、HK等,香港型缺失HK检测示例,少见型地中海贫血基因检测服务（二）益生堂,点突变（测序法） 1: CD74 (GACCAC)、CD78 (-C) CD118（+TCA) 2: CD13 （GCCTCC)、CD30(-GAG) 、 CD31 (AGGAAG)、 CD43/44(-C) 、 CD49(-GC)、 CD59(GGCGAC),少见型地中海贫血基因检测服务（三）益生堂,少见型地中海贫血基因检测服务（四）益生堂,缺失地贫 中国型（chinese） 东南亚型（S.E.Asian） 中国台湾型（Taiwanese）,深圳益生堂生物企业有限公司,谢 谢,