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1、基因克隆主要载体系统 学 生：张建苓 指导老师：胡廷章,1、载体定义 载体(vector)：基因工程重组DNA技术中，将DNA片段（目的基因）转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子。,2、类型 （1）根据功能可分为： 克隆载体 表达载体 整合载体 （2）根据来源可分为： 质粒载体 噬菌体载体 真核细胞克隆载体,3 、载体的共同特征（或应具备的条件）：,自主复制 易于扩增分离纯化 有单一酶切位点（多克隆位点） 单一酶切位点：一种酶在一个载体上只有一个酶切位点 多克隆位点：一个载体上的某一个区域含有多个单一酶切位点 有选择标记基因 表达载体还应有表达调控元件（启动子、增强子、终止子,SD序列）
2、 具有较好的安全性，避免基因的非控制扩散,载体的种类和特征,质粒载体 噬菌体载体 真核细胞的克隆载体,一 、质粒（plasmid）载体 质粒是一种独立于染色体外的小分子环状DNA，一般大小约106-108D，可自身复制和表达，有的质粒还带有可做为选择性标记的抗药性基因，常有1 - 3个抗药性基因，以利于筛选。所以质粒经过适当改选后便可成为良好的载体。 作为载体的质粒大多是由天然质粒经人工适当改造而成的，目前已有多种经改造的良好的质粒载体。,质粒的类型,传递类型： 接合型：含有自主转移基因，使质粒从一个细胞转移到另一个细胞。如： F质粒、部分R、Col质粒 非接合型：不含自主转移基因，质粒不能自
3、主从一个细胞转移到另一个细胞。如部分R、Col质粒 复制类型： 严紧型(stringent plamid):低拷贝，1-3个拷贝/菌 松弛型(relaxed plasmid):高拷贝，10-60个拷贝/菌,(一) 质粒载体,质粒载体包括以下两种： 1.克隆的质粒载体 允许外源的DNA插入，储存。主要是DNA水平上的操作。 2.基因表达的质粒载体 允许外源DNA的插入、储存和表达。,(二) 质粒载体必须具备的基本条件 (1) 具有复制起点； 自我增值的基本条件，一般具一个复制子。 (2) 具有抗菌素抗性； 理想的质粒载体具有两种抗菌素抗性基因。 (3) 具有若干限制酶切单一位点（CMS）； (4
4、) 具有较小的分子量和较高的拷贝数。 低分子量的质粒易于操作，克隆外源片断后仍能有效的转化给受体细胞,同时低分子量的质粒对限制酶具有多重识别位点的几率也较低；较高的拷贝数可获得大量的克隆基因,(三)质粒载体的选择记号 新陈代谢特性； 对大肠杆菌素E1的免疫性； 抗菌素抗性； 四环素抗性、氨苄青霉素抗性、 链霉素抗性、卡那霉素抗性 大多数质粒本身带有抗菌素基因； 抗菌素抗性记号便于操作、易于选择。,(四) 常用的质粒载体,pSC101质粒载体； ColE 质粒载体； pBR322质粒载体； pUC质粒载体； T载体 其它的重要的质粒载体,二 噬菌体载体 （Bacteriophage，简称phag
5、e）,噬菌体的一般生物特性 可脱离寄主细胞生存，但不能进行复制。 除了对寄主的依赖性，还具备其它的功能： 1、保护自己的核苷酸分子（DNA、RNA）免遭环境化学物质的破坏； 2、将其核苷酸分子注入到被感染的细菌细胞； 3、将被感染的细菌细胞转变成制造噬菌体的体系，从而长生出大量的子代噬菌体颗粒； 4、使感染的细菌细胞释放出子代的噬菌体颗粒,噬菌体的结构和其核酸类型： 结构：无尾部结构的二十面体型、 具尾部结构的二十面体型、 线状体型 核酸类型：最常见的是双链线性DNA、双链环形DNA、 单链环形DNA、单链线形DNA、单链RNA。,噬菌体的溶菌生命周期 噬菌体的生命周期分为溶菌周期和溶源周期
6、只具有溶菌生长周期的噬菌体颗粒叫烈性噬菌体。 烈性噬菌体溶菌生长的基本过程： 1、吸附 吸附到位于感染细胞表面的特殊接受器上 2、注入 噬菌体DNA穿过细胞壁注入寄主细胞 3、转变 被感染的细胞成为制造噬菌体颗粒的场所 4、合成 大量合成噬菌体特有的核酸和蛋白质 5、组装 包装了DNA头部和尾部组装成噬菌体的颗粒 6、释放 合成的子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来,噬菌体的分类,根据噬菌体与宿主的关系，将噬菌体分为温和性噬菌体和烈性噬菌体 温和性噬菌体：噬菌体感染宿主细胞后，其DNA与宿主染色体DNA融合，一起复制和传代，无感染其他细胞的能力 烈性噬菌体：噬菌体感染宿主细胞后，其DNA不插入宿
7、主染色体DNA，经过一定的潜伏期，就大量的增殖新颗粒，使宿主细胞裂解，释放出的噬菌体颗粒又感染其他细胞,重要的噬菌体载体,分子生物学中常用的噬菌体载体有： 1.噬菌体载体 （1）类型:插入型载体和替换型载体 （2）应用： 转染作用 转染：由宿主细胞捕获噬菌体或病毒DNA的过程。 转导：以噬菌体为媒介转移遗传物质的过程。 转化：质粒等外源DNA引入细胞的过程。 DNA的体外包装,重要的噬菌体载体,2.粘性质粒（Cosmid）带有噬菌体的Cos位点和整个pBR322的DNA顺序。经感染进入细菌细胞以后在细胞中进行复制。易环化和扩增。分子量小，可包装30-45kb外源基因，可由Ampr抗性筛选，常用
8、于构建基因文库。 粘性质粒载体的特点： (1)具有质粒的性质：自我自制；可转化；包含克隆位点； (2)含有Cos位点：带有噬菌体的黏性末端片段； (3)能承载较大的外源DNA片段：可承载大于自身大小的DNA片段,重要的噬菌体载体,3.单链DNA噬菌体载体-M13噬菌体克隆载体 （1）M13噬菌体的生物学特性： M13是一种含单键（+）DNA（ssDNA）的丝状大肠杆菌噬菌体，其基因组大小为6.4kb。这类载体主要用来获得大量的单链片段，这种单链片段在遗传学研究中主要用来测定序列（sanger双脱氧法）、基因的定点突变研究、异源双链DNA的分析等。,4.噬菌粒载体,由质粒载体和单链噬菌体载体结合
9、而成的新型的载体系列 它具有质粒的复制起点、选择性标记、多克隆位点等，方便DNA的操作，可在细胞内稳定存在；又具有单链噬菌体的复制起点，在辅助噬菌体的存在下，可进行噬菌体的繁殖，产生单链的子代噬菌体。 常用的噬菌粒载体pUC118和pUC119,5.其他载体,（1）酵母人工染色体载体（yeast artificial chromosome, YAC） （2）细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome, BAC） （3）动物病毒DNA改造的载体（如腺病毒、腺病毒相关病毒、逆转录病毒）,三 真核细胞的克隆载体,一、在酵母细胞中克隆基因常用的载体 1.整合型载体（
10、YIP） 2.复制型载体（YRP） 3.附加体型载体（YEP） 二、植物基因克隆的载体Ti质粒 三、动物细胞基因克隆的载体,一、在酵母细胞中克隆基因常用的载体,整合型载体（YIP） YIP型载体是由大肠杆菌质粒和酵母的DNA片段构成的。如Pyeleu10是由ColEI质粒和酵母DNA提供的亮氨酸基因（Leu2+）片段构成，在细菌中复制、扩增，进入酵母后可整合表达。YIP型载体的特点是转化率低(只有1-10转化子/微克DNA)，但转化子遗传性稳定稳定，多用于遗传分析工作。,复制型载体（YRP）,YRP型载体是带有选择标记和复制子的酵母的DNA片段插入到大肠杆菌质粒中构成的。因为它同时含有大肠杆菌
11、和酵母的自主复制基因，所以能在两种细胞中存在和复制 可以在两种截然不同的生物细胞中复制的载体称为穿梭载体（如图3-20），穿梭载体在基因工程中广泛使用。 YRP型载体转化率高，拷贝也高，但不稳定，易丢失。,附加体型载体（YEP）,YEP型载体一般由大肠杆菌质粒、2m质粒以及酵母染色体的选择标记构成。 2m质粒含有自主复制起始区（Ori）和STB区,STB序列能够使质粒在供体细胞中维持稳定。利用2m质粒，人们已经构建出许多YEP型载体。 YEP型载体PYF92就是由酵母的2m质粒、pBR322质粒和酵母的His3+(组氨酸)基因构成的。 YEP型载体对酵母具有很高的转化活性，一般为103-105
12、转化子/微克DNA。比YRP型载体更稳定，拷贝数也高（25-100个/细胞），是基因克隆中的常用载体。,二、植物表达载体,多数植物表达载体是质粒载体 最经典的植物表达载体是pBI121 植物表达载体与克隆质粒载体一样, 可以克隆基因, 但还具备表达所克隆的基因的特性,(15kb),三、动物细胞基因克隆的载体,SV40病毒 SV40病毒载体 (1)取代型重组病毒载体 晚期区段取代载体 早期区段取代载体 (2)重组的病毒-质粒载体,SV40病毒,SV40病毒，环状DNA，外壳蛋白由VP1、VP2、VP3构成。 受纳细胞（permissive cell，也称允许细胞）：能使细胞裂解释放感染性病毒颗粒
13、。 非受纳细胞（non permissive cell）：不产生感染性病毒颗粒，但能整合到细胞染色体中产生癌变。 基因结构: 早期表达区编码大T抗原和小t抗原（即肿瘤蛋白质或抗原）。T抗原的功能是控制SV40基因组的复制和调节。小t抗原的功能不详。 晚期表达区合成Vp1、Vp2、Vp3，包装释放,(1)取代型重组病毒载体,取代型的重组病毒载体是外源DNA直接插入在缺陷型的病毒基因组上。插入的外源DNA片段在大小同被取代的病毒基因组区段是等同的，这样形成的重组体DNA能够在哺乳动物的受纳细胞中增殖，并被包装成病毒颗粒。但为了补充被取代的病毒基因组DNA的功能，必须使用一种与之互补的辅助病毒。,(2)重组的病毒-质粒载体,由大T抗原、复制子和pBR322构成pAC10载体。在细菌中扩增提取基因重组质粒，转染小鼠细胞5-6天后可高拷贝扩增、进而高表达基因产物（如图3-30）。另外微型病毒复制子-质粒载体，可用特殊细胞来克隆和表达,Thanks!,