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1、微生物学实验,实 验 要 求,坚持课前预习 不迟到，不早退，更不能无故缺课； 严格按正确规范实验方法进行实验，作好记录； 保持实验室整洁 注意安全 事实求是地、独立地写好实验报告,实验报告,姓名、班级和学号 实验题目 实验原理（略写） 实验操作（略写） 实验结果 画图 文字描述 分析和讨论 思考题,实验一、油镜的使用、细菌的革兰氏染色和细菌形态的观察,教学目标或要求： 巩固和掌握显微镜油镜的正确使用； 学习细菌制片和单染色技术； 观察细菌的三种基本形态； 对人体上的微生物染色检查，初步建立无菌操作的概念； 学习细菌的革兰氏染色原理和方法 。,显微镜油镜的使用,油镜头的识别和重要参数 油镜物镜的
2、工作原理 油镜的使用方法和注意事项,油镜头的识别和重要参数,放大倍数 数值口径 工作距离,油镜物镜的工作原理,使用油质作为玻片与接物镜之间的介质油浸系 可以增加显微镜的放大倍数 可以增加视野的照明度 可以增大显微镜的分辨率,油镜的使用方法和注意事项,1、用低倍镜对光。最大光圈 2、低倍镜观察（寻找观察目标）。适当缩小光圈 3、高倍镜观察（选取理想的观察目标）。 4、油镜观察：高倍镜观察后- 上升镜筒-油镜转至正下方，在载玻片上加一小滴油-小心地下降镜筒使镜头浸在油里-用粗螺旋将镜筒缓慢上升，寻找目标（物象）用细螺旋调节，使物象清晰-观察记录。最大光圈 5、观察完毕。上升镜筒，转动物镜转换器，使
3、油镜物镜偏位。用干净擦镜纸擦去镜头上的油迹，再取一张擦镜纸醮上二甲苯擦去镜头上残留的香柏油，最后再用一张干净的擦镜纸擦去残留在镜头上的二甲苯。 6、将显微镜各部分还原，放回箱中。,细菌的制片与染色,单染色 复染色,染 料,碱性染料带正电染料。其阳离子部分为发色基团，可与细胞中带负电的组分结合。如结晶紫沙黄, 甲基蓝,碱性复红等。 酸性染料带负电染料。其阴离子部分为发色基团，可与细胞中带正电的组分结合。如刚果红、酸性复红 等。 脂溶性染料如Sudan black。,多数染料都是中性有机盐。据着色基的不同可分为以下类型：,涂片,干燥,固定,染色12min,水洗、吸干,镜检,细菌的单染色,革兰氏染色
4、法：是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。该染色法所以能将细菌分为G+菌和G菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。,革兰氏染色法基本原理,G菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经复红复染后就成红色。 G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色
5、。,1、活材料：培养24小时的大肠杆菌和苏云金芽孢杆菌。 2、染色液和试剂：结晶紫、碘液、95%酒精、石炭酸复红 、蒸馏水、香柏油。 3、器材：载玻片、接种杯、酒精灯、擦镜纸、显微镜。,实验材料,（1）涂片 （2）晾干 （3）固定 （4）结晶紫染色：加适量（以盖满细菌涂面）的结晶紫染色液染色1min；水洗：倾去染色液，用水小心地冲洗。 （5）媒染：碘液，媒染1min；水洗：用水洗去碘液。,方法与步骤,（6）脱色：将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱色1520s至流出液无色，立即水洗。 （7）复染：滴加复红复染1min；水洗：用水洗去涂片上的复红染色液。 （8）晾干：将染好的涂片用吸水纸吸干。 （9
6、）镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色结果。,革兰氏染色法,操作步骤,涂片干燥固定,结晶紫1min水洗,I-KI 1min水洗,95%乙醇脱色约1520s水洗,沙黄或石炭酸复红 1min水洗,干燥镜检,革兰氏阴性杆菌,革兰氏阳性杆菌,实验内容,1、用石炭酸复红对苏云金芽孢杆菌、大肠杆菌进行单染色，在显微镜油镜下观察形态； 2.用混合涂片的方法对大肠杆菌、苏云金芽孢杆菌进行革兰氏染色 3.自选材料：用牙签挑取牙垢观察,1.革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响，难以严格规定。,注意事项,2.染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。 3.选用幼龄的细菌。G+菌培养12h-16h，E.coli培养24h。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。,绘出革兰氏染色后大肠杆菌和苏云金芽孢杆菌的形态图并说明染色结果。 思考题：你认为那些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？如何使你的染色结果可信？,实验报告,谢谢！,