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1、,尿液微量蛋白检测和临床意义,艾 迪 康 医 学 检 验 中 心,“五项”还是“六项”,过敏原,4,项目清楚：,“定性”还是“定量”,最好能写出单个项目名称！,HPV检测 ： HPV6-11、HPV16-18需要取2管分泌物标本,C肽/胰岛素释放试验 ： 需要抽5管血,5,标本少送：,主要内容,尿微量白蛋白,尿IgG,尿2微球蛋白,尿转铁蛋白,尿1微球蛋白,尿视黄醇结合蛋白,分子量：69000 分子直径：3.6nm PI:4.9 肾小球滤过膜：不滤过 肾小管重吸收：少量,一、尿微量白蛋白,理化性质：,分子量：77000 分子直径：3.8nm PI:5.2 肾小球滤过膜：不滤过 肾小管重吸收：少
2、量,二、尿转铁蛋白,理化性质：,分子量：150000 分子直径：10-50nm PI:5.8-7.2 肾小球滤过膜：不滤过 肾小管重吸收：少量,三、尿免疫球蛋白IgG,理化性质：,分子量：11800 分子直径：3.4-3.8nm PI:4.9 肾小球滤过膜：自由滤过 肾小管重吸收：几乎全部,四、尿2微球蛋白,理化性质：,分子量：26000-33000 分子直径：3.6nm PI:3.6-4.4 肾小球滤过膜：自由滤过 肾小管重吸收：99.9,五、尿1微球蛋白,理化性质：,分子量：21000 分子直径：3.8nm PI:4.4-4.8 肾小球滤过膜：自由滤过 肾小管重吸收：95-99,六、尿视黄
3、醇结合蛋白,理化性质：,尿微量蛋白的检测方法,传统测定微量蛋白的方法有酶联免疫吸附试验(ELISA)和放射免疫分析法(RIA)等,其检测精度较差,操作繁杂。免疫散射比浊法操作简便,测量精度较高,结果更准确,但是必须使用特定蛋白分析仪,仪器和试剂昂贵，给使用带来一定的影响，而透射比浊法则可用于各种自动化分析仪，具有速度快、省试剂、适于批量检测的优点为临床上高血压和糖尿病肾损害的早期诊断提供了一个更为快速、简便的方法。,免疫透射比浊法,原理： 利用抗原（白蛋白）和特异性抗体（羊抗人白蛋白抗血清）相结合，形成不溶性免疫复合物，使反应液产生混浊，其浊度高低即透光度减少、吸光度增加反映血清样本中白蛋白的
4、浓度，可由校准品所作的浓度吸光度相应曲线算出。,免疫透射比浊法,影响免疫比浊测定的主要因素 抗原、抗体比例与浊度关系：抗原过量，出现“带现象”，IC分子小，且可发生再解离，浊度下降，光散射减少。抗体过量，IC形成随抗原量增加到抗原抗体最适比例时达高峰。抗体须过量但又必须适量，抗体浓度是测定关键。,免疫透射比浊法,影响免疫比浊测定的主要因素 抗体质量：特异性、效价、亲和力、R型抗体 高亲和性抗体的抗原结合点与抗原表位的空间构型上非常适合，两者结合牢固，不容易解离。反之，低亲和性抗体与抗原形成的复合物较易解离。,免疫透射比浊法,影响免疫比浊测定的主要因素 R型抗体以家兔免疫血清为代表，具有较宽的抗
5、原抗体合适比例范围，只在抗原过量时，才易出现溶性免疫复合物，大多数动物的免疫血均属此型。 H型抗体以马免疫血清为代表，其抗原与抗体的合适比例范围较窄，抗原或抗体过量，均可形成可溶性免疫复合物。人和许多大动物的抗血清皆属H。,免疫透射比浊法,影响免疫比浊测定的主要因素 反应溶液：pH6.58.5，适当浓度电解质（中和抗原抗体复合物表面电荷，促进凝聚）、离子强度（大，IC形成快）；一般常用磷酸盐缓冲液。,免疫透射比浊法,影响免疫比浊测定的主要因素 增浊剂：非离子型亲水剂如聚乙二醇（PEG）、吐温-20等，以PEG6000最好，浓度一般为3%4%。浓度过高可致非特异沉淀。,免疫透射比浊法,免疫比浊法
6、测定的注意事项： 1.标本 3.定标 2.试剂 4.线性,免疫透射比浊法,尿微量白蛋白检测方法,检测方法：,原理： 利用抗原（白蛋白）和特异性抗体（羊抗人白蛋白抗血清）相结合，形成不溶性免疫复合物，使反应液产生混浊，其浊度高低即透光度减少、吸光度增加反映血清样本中白蛋白的浓度，可由校准品所作的剂量相应曲线算出。,微量蛋白检测临床意义,正常肾小球基底膜具有34nm的微孔,并带有一层负电荷,即具有孔径屏障和电荷屏障,使血浆中带负电荷的中等分子及大分子蛋白质不易通过。在正常情况下,肾小球滤液中的小分子蛋白质95%99%可通过肾小管重吸收,因而尿液中蛋白质含量很少。正常生理情况下,尿中这些蛋白质含量仅
7、为微克或毫微克水平,在各种致病因子作用下,肾小球滤过膜和肾小管发生结构和功能损伤,使尿液中蛋白质过高,超过了肾小管的重吸收功能而出现蛋白尿。,（1）标本由临床运送至实验室要尽可能 快，必须分离出血清（浆）后运送； （2）标本运送要注意防止标本外溢、蒸发和污染（标本管要盖盖子）； （3）足量。,四、标本保存与运送：,每一个标本都是唯一的，不可替代的！ 每一个标本都是危险的，具有潜在传染性！,肾 小 球 滤 过 膜 示 意 图,微量白蛋白检测临床意义,微量清蛋白尿对早期肾损害诊断具有重要意义。实践证明,单一指标有其局限性。因为早期肾损害不仅是肾小球损害,有的可以是肾小管功能的受损,也可以是两者同时
8、受损。 正常尿中蛋白质以白蛋白为主，而分子量低于50 000的蛋白质大部分被肾小管重吸收，而尿中含量极微。健康人尿中mAlb95%可信限95%可信限，即为早期肾小球损伤。这类患者处于疾病早期，及时检出进行治疗，可阻断病情向不可逆蛋白阶段发展，对提高病人今后的生存质量和减轻社会医疗经济负担具有重大意义。,微量白蛋白检测临床意义,进十年来，mAlb检测方法经过放射免疫法，酶免疫法和免疫浊度法3个阶段，已逐渐成熟起来。目前，免疫浊度测定技术已得到推广。速率散射浊度法灵敏度，准确度，精密度均较好，但需用高质量的特种蛋白分析仪。而透射比浊法则可用于各种自动化分析仪，具有速度快、省试剂、适于批量检测的优点
9、。,转铁蛋白检测临床意义,转铁蛋白和白蛋白一样均属小分子带负电荷蛋白。前者分子量为77000，直径为3.8nm，后者为66000，分子直径为3.6nm。虽然转铁蛋白分子量略大于白蛋白，但所带的负电荷明显小于白蛋白。由于漏出肾小球基底膜的蛋白质除了要受基底膜网孔大小屏障的影响外，还要受到电荷屏障的影响。肾小球基底膜上存在大量带负电荷的蛋白，如硫酸肝素糖蛋白、唾液酸等，可阻止带负电荷的循环蛋白从肾小球中滤过。糖尿病肾病早期、肾小球基底膜电荷屏障功能减退早于裂孔大小屏障，故带负电荷少的TF比白蛋白更容易被肾小球滤过。因此对糖尿病早期肾病的预测，尿TF比微量白蛋白更敏感。在高血压肾病时，尿TF也可显著
10、增高。,转铁蛋白检测临床意义,TRF为中分子蛋白，常作为尿蛋白选择性指数的计算指标。在急性肾小球肾炎、慢性肾小球肾炎、慢性肾功能不全等疾病中尿TF均可升高。 血清转铁蛋白的临床意义： 血清TRF浓度受铁离子供应的调节，与血浆中铁离子浓度呈负相关。测定血清中TRF含量可用于贫血的诊断、疗效观察、肝病预后判断。TRF也是一种负时相反应蛋白。 增高：常见于缺铁性贫血、妊娠未期、口服避孕药及使用雌激素等。 减少：常见于严重肝病、营养不良、急慢性炎症、恶性肿瘤、结缔组织病、肾病综合症、慢性肾功能衰竭、严重烧伤、胃肠道疾病及再生障碍性贫血等。,转铁蛋白检测临床意义,脑脊液TRF的临床意义： 增高可见于吉兰
11、-巴雷综合症、结核性脑膜炎、神经系统肿瘤、脑出血及慢性缺铁性贫血。 减少：可见于急慢性中枢神经系统感染、脑膜白血病及脑肿瘤等。,尿免疫球蛋白G检测临床意义,免疫球蛋白是指具有抗体活性或化学结构上与抗体相似的球蛋白。根据其重链定区的分子结构与抗原特异性不同,可分为五类,即IgG、IgA、IgM、IgE、IgD。人血清中以IgG含量最多,占血清中Ig7580%。主要由脾脏和淋巴结中浆细胞合成,半衰期约23天。它较其他Ig更易透过毛细血管壁,弥散到组织间隙中。人体任何组织中都有IgG分布。IgG的分子量为1517万而正常肾小球滤过膜只允许分子量4万的蛋白通过。故血清中IgG不能通过肾小球滤过,尿液含
12、量甚微。,尿免疫球蛋白G检测临床意义,实验证明,分子量40万的蛋白,可通过毛细血管内皮孔,但被基膜阻拦。分子量16万,可通过内皮孔和基膜,但被足细胞裂孔膜阻拦。分子量4万,能通过三层滤过膜而进入肾小球囊。故分子量1517万IgG,能反映肾小球滤过膜基膜受损情况。有人检测尿IgG以表示尿蛋白的选择程度,以反映肾小球滤过膜的“漏洞”,若尿中IgG含量增高,尿蛋白选择性差,肾小球滤过膜损害严重,预后差。,尿2微球蛋白检测临床意义,正常人血清内2-M浓度相当恒定，0.82.0mg/L(平均为1.8mg/L)，临界范围是2.02.4mg/L，2.5mg/L以上为异常。 2-M容易通过肾小球滤膜，但几乎全
13、部由近曲小管以胞饮形式摄取，在局部被代谢降解为氨基酸。正常人每天从肾小球滤过的2-M约为340mg，但尿中每天最大排泄量只有370ug，仅占滤过总量的0.1%。尿中正常健康人2-M浓度为0.030.37mg/L(或0.30mg/L或0.20mg/gCr)。,尿2微球蛋白检测临床意义,尿液中的2-M不很稳定，酸性尿，尤其是pH5.2以下时极易分解。测定尿液2-M的标本，取得后及时测定或调节pH6.57.0，放冰箱保存。,尿2微球蛋白检测临床意义,2-M测定的临床意义： 1.评价肾小球疾病： 对肾小球滤过功能，其敏感度显著高于目前常规应用的血肌酐测定，部分患者的肾小球功能虽已受损，当血肌酐还不能反
14、映异常时，血2-M已显示肾功能的异常。因此，对血肌酐测定处于盲区而肾小球滤过功能已受损害的患者，测定其尿中2-M有利于早期发现肾小球滤过功能异常。 对IgA肾病，尤其是肾小球硬化者，即使肾功能正常，2-M也增高，可能由于该类疾病的患者体内免疫反应较强，淋巴细胞被激活，从T和B淋巴细胞中释放的2-M增加之故。,尿2微球蛋白检测临床意义,2.评价肾小管疾病： 可早期识别氨基甙类抗生素或镉等在金属的肾中毒。药物主要集中在近端小管，当局部浓度高出血清50倍时，往往在血肌酐升高前46天，尿中2-M即可增加两倍以上。对于重金属中毒肾损害的流行病调查，尿2-M可作为筛选试验。 2-M水平为小管间质性疾病的灵
15、敏指标，如Bartter综合症、万可尼综合症、Willson病，以及原发性间质性肾炎等，尿中2-M均升高。,尿2微球蛋白检测临床意义,3.鉴别上尿路与下尿路感染：上尿路感染时累及肾小管，而下尿路感染则无肾小管损伤。因此，测定尿中2-M可确定感染部位。动态观察有助于疗效观察及早期发现复发者。,尿2微球蛋白检测临床意义,4.监测肾移植后排异反应：肾移植刚完成时，血清2-M有时比肌酐下降得更早。因为肾移植后存活的肾小管细胞分解了从原尿或肾小管周围毛细血管重吸收的2-M。发生排斥反应时，由于肾功能下降，加上排斥引起的炎症刺激宿主的淋巴细胞而使2-M合成增加、血清2-M升高，往往比血肌酐升高要早几天。因
16、此，血、尿2-M的变化对早期识别排斥反应提供了一项的价值的辅助诊断指标。无排斥或偶有轻度排斥反应的肾移植病人尿2-M不高，有排反应者，在排斥期前17天就可以见到尿2-M明显升高。在没有肾功衰竭时，尿2-M增高一般表示移植后免疫损伤引起的肾小管功能障碍。由于免疫抑制剂可影响2-M的合成，在采用此类制剂控制急性排斥时，对2-M变化的意义就难以评价了。,尿2微球蛋白检测临床意义,5.某些恶性疾病和免疫性疾病，2-M合成加快，导致血2-M升高，但尿液2-M并不随之升高。如多发性骨髓瘤、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、何杰金氏病、干燥综合症、淋巴瘤、白血病、爱滋病、肝炎等，在无肾功能损害的情况下，血2-
17、M也升高。判断这些疾病患者2-M增高的意义时，必须除去肾外因素。 血2-M水平升高，由于GFR降低者，主要见于肾功能衰竭。长期血液透析病人，血清2-M浓度明显升高，其水平与血液透析的疗程长短呈正相关。长期血液透析，可出现淀粉样变，其原纤维(Fibrils)的主要构成部分为2-M，腹膜透析不出现 上述现象。,尿1微球蛋白检测临床意义,尿1-微量蛋白1-MG是一种小分子蛋白, 分子量约为26000-33000u的糖蛋白，由肝脏产生。存在于血中的游离型1-MG可经肾小球滤过膜自由滤过并极大部分被肾近曲小管重吸收而分解。正常情况下,尿1-MG排泄甚微,当肾近曲小管受损时,排泄率明显增加,因而尿1-MG
18、是反映肾近曲小管受损的敏感指标，由于尿中微球蛋白不受PH值影响，一般认为血清或尿液标本在pH48之间，4保存一周，1-微球蛋白仍可保持稳定。因此在肾脏疾病诊断中具有重要的临床应用价值。,尿1微球蛋白检测临床意义,临床意义： 1. 肾功能损伤的早期诊断：1-MG作为低分子量蛋白质，在肾小管性蛋白尿，肾小球性蛋白尿和混合性蛋白尿患者排泄量均明显增加。故在肾小球肾炎、肾功能不全、高血压、糖尿病和抗生素及其它药物引起的肾脏损害中，尿中-MG均可增加。,尿1微球蛋白检测临床意义,2. 鉴别诊断上泌尿道与下泌尿道感染、肾性与肾后性血尿和蛋白尿：在上泌尿道感染。肾性血尿和蛋白尿时尿中1-MG明显增多。反之下
19、泌尿道感染及肾后性血尿和蛋白尿时尿中1-MG无明显增多。,尿1微球蛋白检测临床意义,3. 尿1-微球蛋白升高： 肾小球、肾小管发生病变时，尿1-微球蛋白水平升高，与判断肾功能的另外二项指标2-微球蛋白(2-M)和肌酐(Cr)呈密切相关。肌酐廓清率(Ccr)在100ml/分以下时，1-微球蛋白升高，Ccr为80ml/分以下时，2-M开始升高。可见1-微球蛋白比2-M敏感，而且患恶性肿瘤时不升高，因此，与2-M相比，1-微球蛋白在早期和鉴别诊断肾功能方面更具有临床价值 。,尿视黄醇结合蛋白检测临床意义,视黄醇结合蛋白(retinol-bindingprotein,R为血中维生素A的特异转运蛋白。1
20、968年Kanai等首次分离发现了RBP,1971年Peterson和Berggard从尿中将其分离。RBP为低分子量蛋白,能自由滤过肾小球,近端肾小管几乎完全重吸收,其在血尿中变化与肾脏疾病密切相关。,尿视黄醇结合蛋白检测临床意义,。,RBP的理化特性和生理功能，RBP为一种单一肽链蛋白质,含有184个氨基酸残基和3个二硫键,有一个结合一分子全反式视黄醇的结合点。RBP分子量为21000,沉降系数2.132.30,等电点为pH4.44.8,半衰期约为312小时,合成率为每天公斤体重5mg。RBP在肝脏合成,受到全反式视黄醇刺激后分泌出来，释放入血后与视黄醇(retinol,ROH)、甲状腺素
21、运载蛋白(transthretin,TTR)以1:1:1的比例形成三元复合物。分泌入血的RBP量受到视黄醇的严格调控。,尿视黄醇结合蛋白检测临床意义,RBP在肾脏的代谢，RBP为一种小分子量蛋白,能自由滤过肾小球,部分肾小管重吸收RBP达99.97%,健康人尿中只有极少量。血清RBP结合VitA通过肾小球部分滤过。RBP在血中的半衰期只有312小时,因此RBP在尿中的浓度变化可动态反应肾小管功能的变化。在检测尿RBP时,取标本后应迅速将pH校正为7为好。Donadio等研究血清中三种低分子量蛋白胱氨酸蛋白酶抑制剂C(CystC)、2-MG、RBP作为肾小球滤过率(GFR)损坏标志与血清肌酐(C
22、r)对比认为RBP作为肾小球滤过率的标志物不如CystC、2-MG、Cr。,尿1微球蛋白检测临床意义,RBP在健康人尿中含量很低,其检测方法在临床运用中显得尤为重要。目前检测血尿中的RBP方法较多,常用的有放射免疫扩散、免疫浊度、免疫电泳、酶联免疫吸附和放射免疫分析,其中灵敏度高,实用性强的为酶联免疫吸附法和放射免疫法。众多学者认为尿RBP作为近端肾小管功能受损指标比N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)更敏感,在酸性尿中比2-微球蛋白(2-MG)更稳定。,尿1微球蛋白检测临床意义,1.尿RBP已成为近端肾小管功能受损的一项可靠指标 2.尿中肾小管损害标志物可能是肾病综合征激素治疗不敏感的危险因素 3.检测尿中RBP在诊断早期糖尿病肾病是一个较敏感的指标 4.检测尿中RBP可作为狼疮性肾病活动期的标志物。 5.尿中RBP的监测对临床掌握高血压组患者肾小管损害程度有意义。,THANKS,