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1、.,第三章,谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养,.,目录 contents,1,2,3,4,谷氨酸生产菌的主要特征,国内谷氨酸生产菌及其比较,谷氨酸生产菌在发酵过程中的形态变化,谷氨酸发酵的代谢控制育种策略,5,利用生物工程技术选育谷氨酸生产菌,6,菌种的扩大培养及种子的质量要求 ,.,第一节. 谷氨酸生产菌的主要特征,一、现有谷氨酸生产菌的分类,现有谷氨酸生产菌主要是棒状杆菌属、短杆菌属、小杆菌属及节杆菌属中的细菌。,1. 棒状杆菌属(Corynebacterium),直到微弯的杆菌，一端膨大呈棒状，折断分裂形成“八”字形或栅状排列。葡萄糖发酵产酸，G+,.,2 短杆菌属(Brevibact
2、erium),短的不分枝直杆菌。多数从葡萄糖发酵产酸，不发酵乳糖。 G+,3 小杆菌属(Microbacterium),形态与棒状杆菌相似。发酵葡萄糖产酸弱，主要产乳酸。 G+,.,4 节杆菌属(Arthrobacterium),培养过程中，细胞形态变化较大 球菌 杆菌，杆菌 球菌。 G+ G- , G- G+,能液化明胶，从碳水化合物产酸极少或不产酸。,.,二、谷氨酸棒状杆菌基因组研究进展,谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032,GenBank NC-004369,.,.,目前应用发酵法生产L-乳酸常用的微生物仅有两大类:一类为细菌,多采用乳酸菌,另一类为根霉。根霉可以直接利用淀粉质原料生产L-
3、乳酸,但是产酸量低,副产物多,转化率低。Sauer等构建了包含乳杆菌L-乳酸脱氢酶基因的毕氏酵母,它利用木糖发酵,初始浓度为100g/L，生产L-乳酸达到58g/L，比利用葡萄糖产生乳酸的水平高。,基因工程育种（重组DNA技术）,.,三、现有谷氨酸生成菌的主要特征,（1）细胞形态球形、棒状以及短杆状。 （2）G+，无芽孢、无鞭毛，不能运动。 （3）需氧型、生物素缺陷型微生物。 （4）脲酶强阳性 （5）不分解淀粉、纤维素、油脂、酪蛋白以及明胶。 （6）发酵中菌体发生明显的形态变化，同时发生细胞膜渗透性的变化。 （7）CO2固定反应酶系活力强。,.,（8）异柠檬酸裂解酶活力弱，乙醛酸循环弱。 （9
4、）-酮戊二酸氧化能力微弱。 （10）NADPH2进入呼吸链能力弱。 （11）柠檬酸合成酶、乌头酸梅、异柠檬酸脱氢酶以及谷氨酸脱氢酶活力强。 （12）能利用醋酸，不能利用石蜡。 （13）具有向环境中泄露谷氨酸的能力。 （14）不分解利用谷氨酸，并能耐高浓度的谷氨酸，产谷氨酸5%以上。,.,第二节 国内谷氨酸生产菌及其比较,1、形态特征 短杆至小棒状，有时微弯曲，两端钝圆，不分枝，呈多种形态。 单个、成对及“V”字形排列。 G+。胞内有横隔。不运动。无芽孢。,一、 北京棒杆菌(AS1299)的形态和生理特征,.,2、培养特征,普通肉汁琼脂平板：菌落圆形， 24h白色，48h淡黄色，中央隆起，表面湿
5、润、光滑，有光泽，边缘整齐且呈半透明状，无黏性，不产生水溶性色素。,.,3、生理特征, 对氧的要求：好氧及兼性厌氧。 与温度的关系：菌株2637 培养生长良好，不耐高温，41 生长较弱。 pH的影响： Ph510均能生长，最适 pH67.5。 还原硝酸盐：反映强烈。 石蕊牛奶培养：7d后微产碱。 不水解淀粉，不分解纤维素。 对尿素的耐力，2.6%以上生长受抑制。 脲酶试验：强阳性反应。 产酸物质的测定：G、果糖、甘露糖、蔗糖、麦芽糖迅速产酸。 生长因素试验：生物素是必需生长因素。硫胺素明显促生长。,.,二、钝齿棒杆菌(AS1542)的形态和生理特征,1、 形态特征 短杆至棒状，有时微弯曲，两端
6、钝圆，不分枝。单个、成对及“V”字形排列。 折断分裂。 G+。胞内有横隔。不运动。无芽孢。,.,2、 培养特征,普通肉汁琼脂平板：菌落圆形，近草黄色， 表面湿润、光滑，无光泽，边缘顿齿状，较薄，半透明，无黏性，不产生水溶性色素。,., 对氧的要求：兼性厌氧。 与温度的关系：菌株2037 培养生长良好，不耐高温，42 不生长。 pH的影响： pH69生长良好， pH10生长微弱， pH45已不能生长。 还原硝酸盐：反映强烈。 石蕊牛奶培养：7d后微产碱。 水解淀粉，不分解纤维素。 对尿素的耐力，2.6%以上生长受抑制。 脲酶试验：强阳性反应。 产酸物质的测定： G、果糖、甘露糖、蔗糖、麦芽糖、水
7、杨苷、七叶灵等迅速产酸。 生长因素试验：生物素是必需生长因子。,3、生理特征,.,三、天津短杆菌(T613)的形态和生理特征,典型的短杆状，有时微弯曲，两端稍钝圆，不分枝。单个、成对及“V”字形排列。折断分裂。 G+。不运动。无芽孢。,1、形态特征,.,2、培养特征, 普通肉汁琼脂平板：菌落圆形，浅黄色， 表面湿润、光滑，隆起，边缘整齐，较薄，半透明，无黏性，不产生水溶性色素。,.,3、生理特征, 对氧的要求：好氧及兼性厌氧。 与温度的关系：菌株2637 培养生长良好，75 处理10min不再生长。 pH的影响： pH610生长良好， pH5生长微弱， pH4和pH11已不能生长。 还原硝酸盐
8、：反映强烈。 不水解淀粉，不分解纤维素。 对尿素的耐力，5%以上生长受抑制。 脲酶试验：强阳性反应。 产酸物质的测定：G、果糖、甘露糖、蔗糖、麦芽糖、水杨苷、七叶灵 生长因素试验：生物素是必需生长因子。硫胺素是促生长作用。,.,四、北京棒杆菌(7338)与钝齿棒杆菌(B9)的比较,后提取容易，收率较高，质量较好,分泌色素较多,.,2.5 天津短杆菌(T613)与钝齿杆菌(B9)的比较,T613感染噬菌体时，不能换用B9，调换7338.,.,第三节 谷氨酸生产菌在发酵过程中的形态变化,斜面和一、二级种子在不同培养条件下，细胞形态基本相似。斜面培养的菌体较细小,一、二级种子比斜面菌体大而粗壮,革兰
9、氏染色深。多为短杆至棒杆状,有的微呈弯曲状,两端钝圆,无分枝;细胞排列呈单个、成对及“V”字形,有栅状或不规则聚块;分裂的细胞大小为0.70.9*1.03.4um。由于生物素充足,繁殖的菌体细胞均为谷氨酸非积累型细胞。,一、 种子的菌体形态,.,二、谷氨酸发酵不同阶段的菌体形态,长菌型细胞：发酵0-8h或0-10h。短杆至棒状，有的微弯曲状，细胞单个、成对及 V字形排列。,转移期细胞：发酵8-18h或10-20h。细胞开始伸长、膨大。在生物素贫乏的条件下，从谷氨酸非积累型转变成谷氨酸积累型。转移期有长菌型细胞，也有产酸型细胞。,.,产酸型细胞：发酵16-20h后。细胞为含磷脂不足的异常状态，呈
10、伸长、膨大、不规则状，缺乏V字形排列。发酵后期，细胞较长，呈有明显的横隔的多节细胞，产酸高。,过量生物素，不同阶段的细胞形态则基本上没有明显的变化。菌体较粗壮，类似于长菌型细胞。典型的异常发酵，长菌体、耗糖快、耗尿素快、发酵周期短、低酸或不产酸。,.,三、谷氨酸发酵感染噬菌体后的菌体形态,发酵前期感染噬菌体后,菌体细胞明显减少,细胞不规则,发圆、发胖,缺乏字形排列,有明显的细胞碎片,严重时出现拉丝、拉网,互相堆在一起,几乎找不到完整的菌体细胞,类似蛛网或鱼翅状。,.,在发酵中、后期感染噬菌体后,菌体细胞形态不规则,边缘不整齐,有的边缘似乎有许多毛刺状的东西,有细胞碎片 。,.,第四节、谷氨酸发
11、酵的代谢控制育种,一、日常菌种工作,1、定期分纯 1-2个月分离纯化一次,.,2、小剂量诱变刺激,用紫外线（10-20s）处理，可以淘汰生长微弱的菌株，并能激发溶原性噬菌体，使挑出来的菌产酸高、生长旺盛、无噬菌体感染。,.,3、高产菌制作安瓿管,育种后分纯的高产菌种需保存到安瓿管中，防止菌种变异。,.,二、选育耐高渗透压菌种,耐高糖突变株 选育在含20-30%葡萄糖的平板上生长好的突变株。 耐高谷氨酸突变株 选育在含15-20%味精的平板上生长好的突变株。 耐高糖、高谷氨酸突变株 选育在含20%葡萄糖、15%味精的平板上生长好的突变株。,.,三、 选育不分解利用谷氨酸的突变株,选育以谷氨酸为唯
12、一碳源菌体不长或生长微弱的突变株。,四、选育细胞膜渗透性好的突变株,生物素亚适量,吐温-60,青霉素,温度敏感株,.,五、 选育强化CO2固定反应的突变株 六、选育减弱乙醛酸循环的突变株 七、选育强化三羧酸循环中从柠檬酸到 -酮戊二酸代谢的突变株 八、选育解除谷氨酸对谷氨酸脱氢酶反 馈调节的突变株 九、选育强化能量代谢的突变株,耐谷氨酸、谷氨酸结构类似物、谷氨酰胺抗性突变株,.,第五节 利用生物工程新技术选育谷氨酸生产菌,一、应用原生质体融合技术,.,钝齿棒杆菌B9 (细胞个体大、易于提取；产酸率低),天津短杆菌TG-866 (产酸率高),融合子F263(细胞个体大、产酸率高),.,二、应用转
13、化法,.,三、应用转导法,.,四、应用重组DNA技术,.,第六节 菌种的扩大培养和种子的质量要求,一、菌种扩大培养的目的,接种量的需要,菌种的驯化,缩短发酵时间、保证生产水平,.,二、菌种扩大培养的过程,.,1、斜面菌种的培养,培养基：葡萄糖0.1%，蛋白胨 1%，牛肉膏1%，氯化钠 0.25% ，酵母膏0.5%，琼脂 2%， pH 7.0-7.2,培养基特点：有利于菌体的生长，原料比较精细。,生长斜面要求： 32，生长18-24小时，生长良好， 所使用斜面连续传代不超过3次,.,2. 一级种子培养（摇瓶）,培养条件：于1000ml三角瓶中，装液200-250ml,32 培养12小时。,培养基
14、：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米浆 2.5%， K2HPO4 0.1%，FeSO4 2mg/k , MnSO42mg/kg PH7.0,培养基特点：有利于菌体的生长，所使用的原料 已经基本接近于发酵培养基.,.,一级种子培养的质量要求：,种龄：12h PH：6.4 光密度：OD值净增0.5以上 残糖：0.5%以下 噬菌体检查：无 镜检：菌体生长均匀、 粗壮，排列整齐 革兰氏染色：阳性反应。,.,3. 二级种子培养(种子罐),培养基：水解糖液3%，尿素0.4%， Na2HPO4 0.3%，玉米浆 2.5%，KCl 0.14%，消泡剂0.5-1kg，PH7.0,培养条件：在种子罐中培养（容积为发酵
15、罐的1%），32培养7-10个小时,.,二级种子培养操作流程,种子罐配料,培养基加至罐体积60-75%,空消,0.2MPa，130,50min,打料,实消,接种,0.1 MPa，118,5min,.,二级种子培养的质量要求：,种龄：7-8h PH：7.2 光密度：OD值净增0.5以上 残糖：消耗1%左右 噬菌体检查：无 镜检：菌体生长旺盛， 排列整齐 革兰氏染色：阳性反应。,.,三、影响种子质量的主要因素,培养基,温度,pH值,溶解氧,接种量,种龄,.,本章作业：,一、简述现有谷氨酸生成菌的主要特征。,二、简述谷氨酸发酵不同阶段的菌体形态。,三、谷氨酸发酵日常菌种工作有哪些？,四、简述菌种扩大培养的一般过程。,五、简述二级种子培养操作流程。,.,本章结束 感谢观看！,