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1、.,.,蛋白质分离的原理：,根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同种类的蛋白质。,一、基础知识,.,凝胶色谱法（分配色谱法）,1、概念：根据被分离物质（如蛋白质）相对分子质量的大小，利用具有多孔网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离。,性质：微小的多孔球体 本质：多糖类化合物 实例：葡聚糖、琼脂糖,.,.,凝胶色谱法分离蛋白质,.,.,2、凝胶色谱法的原理,.,（二）缓冲溶液,能够抵制外界的酸和碱对溶液PH值的影响，维持PH基本不变。,1、作用:,2、缓冲溶液的配制:,通常由12 种缓冲剂溶解于水中配制而成
2、。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PH范围内使用的缓冲液。,.,（二）缓冲溶液,3、 在本课题中使用的缓冲液是： 磷酸缓冲液,成分：NaH2PO4 /Na2HPO4,.,（三） 电泳：,1、概念：,带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。,.,2、原理：,许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电。 在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。 电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。,.,3、类型:,琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺
3、凝胶电泳。,.,聚丙烯酰胺凝胶电泳,在测定蛋白质分子量时常用十二烷基硫酸钠（SDS）聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。,N,N-亚甲基双丙烯酰胺（形成交联）,丙烯酰胺和交联剂 N,N-亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚反应,.,蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。,.,SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是单条肽链的分子量。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质SDS复合物，SDS所带负电荷
4、的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。,SDS作用机理:,.,实验操作步骤,1、样品处理 2、粗分离 3、纯化 4、纯度鉴定,.,血液有哪些成分？,.,每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色。,血红蛋白的特点：,.,1、 红细胞的洗涤 2、血红蛋白的释放 3、分离血红蛋白溶液 4、透析,（一）样品处理,.,问题： 1、刚采集的血样要做 怎样的处理？为什么？ 加入抗凝血剂， 防止血液凝固。 2、怎样洗涤？ 采样分离吸浆倒红加液搅拌重洗三次 低速短时间离心 生理盐水,1
5、、红细胞的洗涤,.,3、洗涤的目的是什么？ 去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化。 4、洗涤干净的标志是什么？ 直至上清液不再呈现黄色，表明红细胞已洗涤干净。,1、红细胞的洗涤,.,2、血红蛋白的释放,问题： 加蒸馏水和甲苯的作用是什么？ 使红细胞破裂，释放出血红蛋白。,.,有机溶剂（无色透明的甲苯层） 脂类物质（白色脂溶性物质沉淀层） 血红蛋白溶液（红色透明液体） 红细胞破碎物沉淀（ 暗红色沉淀物）,3、分离血红蛋白溶液,高速离心滤纸过滤漏斗分液,.,血红蛋白,.,(4)透 析：,过程：取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/l的磷酸缓
6、冲液中（pH为7.0），透析12小时。 透析目的：除去样品中分子量较小的杂质。,.,.,2.凝胶色谱操作:,（1）凝胶色谱柱的制作：,.,（2）凝胶色谱柱的装填,凝胶的选择： A、材料：交联葡聚糖凝胶（G-75）。 B、代表意义：“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围。75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克。 凝胶的前处理：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。,.,凝胶色谱柱的装填方法： A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。 B、装填：将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。 注意： 1、凝胶装填时尽量紧密
7、，以降低凝胶颗粒之间的空隙。 2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。,（2）凝胶色谱柱的装填,.,洗涤平衡： 注意：1、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。 2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。,50cm高,（2）凝胶色谱柱的装填,.,（3）样品加入与洗脱,调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。 滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。,.,注意：正确的加样操作是：1、不要
8、触及并破坏凝胶面。 2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。,.,样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口 洗脱：小心加入pH=7.0 的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。 收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）,.,.,（三）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（选做）,鉴定血红蛋白纯度。,1.目的：,.,1.样品的处理通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液 2.样品的粗
9、分离经过透析去除分子量较小的杂质 3.样品的纯化通过凝胶色谱法将相对分子质量较大的杂质蛋白除去 4.经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。,小结：你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？,.,观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图5-18），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。,三、结果分析与评价,1、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？,.,2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？,由于凝胶是一
10、种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖2000或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。,.,如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。,3、你能观察到蛋白质的分离过程中红色区带的移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离效果？,