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1、.01 血清球蛋白的分离与纯化【目的要求】1.掌握分离纯化蛋白质的基本原理和基本过程。2.熟悉盐析、离心、层析、电泳、比色等生物化学基本技术在蛋白质分离纯化中的综合应用。4.学会设计和制定分离纯化蛋白质的实验方案、技术路线和质量监控和保证措施。【实验原理】不同蛋白质的理化性质和生物学性质各有不同，利用这些不同便可获得分离纯化。血清蛋白有300多种,可粗略分成清、球蛋白两大类，球蛋白只是球蛋白中的一个亚类。欲用常规方法获得，可先用半饱和硫酸铵从血清中盐析出球蛋白，接着用葡聚糖凝胶G25（Sephadex25）脱去球蛋白中的盐分（硫酸铵），最后用DEAE（二乙基氨基乙基）纤维素阴离子交换柱，便可直
2、接从脱盐的球蛋白溶液中分离纯化出球蛋白，其反应机理如下：被柱层析交换结合的球蛋白和球蛋白，可通过增加洗脱液的离子强度或降低洗脱的精品.pH值（也可两者同时改变），使其分部洗脱下来而被纯化。纯化前后的球蛋白可用电泳方法进行比较鉴定。【实验准备】一、器材1.离心机2.层析柱(直径约1-1.2cm,长约30cm)3.电泳仪二、试剂1.饱和(NH4)2SO4溶液 称固体(NH4)2SO4（分析纯）850g置于1,000ml蒸馏水中，在7080水中搅拌溶解，室温中放置过夜，瓶底析出白色结晶，上清液即为饱和(NH4)2SO4液。2.葡聚糖凝胶G25按每100ml凝胶床需干的葡聚糖凝胶G25 25g，置于锥
3、形瓶中，按每克干胶加入蒸馏水约30ml，轻轻摇匀并于沸水浴中加热1小时，或于室温浸泡24小时，搅拌后稍静置，倾去上清细粒，用蒸馏水漂洗。3.0.075mol/L pH6.3磷酸缓冲液(pH6.3 PBS)0.0175mol/L NaH2PO4液秤取NaH2PO4 2H2O 2.730g溶于100ml蒸馏水中，转入1000cc容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度即成。0.0175mol/L Na2HPO液秤取Na2HPO412H2O 6.269g，如配制即成。取液77.5ml、液22.5ml，混匀后即成0.075mol/L pH6.3的磷酸缓冲液。4.20%磺基水杨酸。5.Nesseler试剂6.血清醋
4、酸纤维薄膜电泳实验的全套仪器及试剂。7.DEAE（二乙氨基乙基）纤维素处理 按100ml柱床体积称取DEAE纤维素14g，每克加精品.0.5mol HCl 15ml搅拌，放置30分钟（HCl处理时间不可太长，否则DEAE纤维素变质），加约10倍量的蒸馏水搅匀，放置片刻，待纤维素下沉后，倾弃含细微悬浮物的上层液，如此反复23次，沉淀30分钟，虹吸吸去上清或布氏漏斗抽滤，如此水洗至清液pH4为止。加等体积1mol NaOH，使最终浓度约为0.5mol NaOH，搅拌后，放置30分钟，以虹吸吸去上层液体，同上用蒸馏水反复洗至pH7为止，虹吸吸去上层液体，然后加入0.0175mol/L pH6.3磷酸
5、缓冲液使之平衡，置4冰箱内保存备用。【实验操作】1.(NH4)2SO4盐析 取血清2.0ml，缓慢滴入饱和（NH4）2SO4溶液2.0ml，边加边搅，混匀后于室温中放置10分钟，然后3000转离心10分钟，并小心倾去上清液。沉淀加0.0175mol/L pH6.3磷酸缓冲液1ml，使之溶解，作为纯化球蛋白用。2.凝胶层析脱盐葡聚糖糖凝胶G25层析柱的准备：取层析柱垂直夹于架上，关紧下端出口，加蒸馏水少许，缓慢加入膨胀处理过的凝胶悬液，待底部凝胶沉积到12cm时，再打开出口，并用玻璃棒插入到凝胶床表面下，轻轻搅动，继续加入凝胶，待凝胶下沉至1015cm高（防止凝胶分层和柱内混有气泡，使表面平整并
6、盖一尼龙布或塑料片）。用0.0175mol/L pH6.3磷酸缓冲液流洗平衡后，即可使用。上样与洗脱：小心控制凝胶柱下端活塞，使柱上的缓冲液面刚好下降到凝胶床表面（注意不要使液面低于凝胶床表面以致空气进入凝胶床）。关紧下端出口，用滴管吸取盐析球蛋白液，小心缓慢加到凝胶床表面上（注意不要将凝胶粒冲起或破坏凝胶床表面的平整）。开下端出口，使样品进入凝胶床后再加少量的缓冲液，如此重复三次，以洗净柱内壁上的样品溶液，然后可加入适量的缓冲液洗脱。加样开始后应立即收集洗脱液，流速约0.5ml/分钟，每2分钟收集一管。洗脱液中蛋白质与NH+4的检查：取比色皿2个（一个为黑色背底，另一个为白色），按洗脱液的管
7、号顺序分别取1滴，滴于比色皿中，前者各加20%磺基水杨酸2滴，出现白色混浊或沉淀即有蛋白质析出，由此可估计蛋白质在洗脱各管中的分布及浓度。于另一比色皿中各加入Nesseler试剂1滴，以观察NH+4出现的情况(若有棕黄色，即碘化双汞铵NH2Hg2I2生成，说明有NH+4的存在)。合并球蛋白含量高的各管，用DEAE纤维素阴离子交换柱纯化。纯化前后取样鉴定。3.DEAE纤维素阴离子交换层析 经处理再生后的EDAE纤维素，按上法装柱，用0.0175mol/L pH6.3磷酸缓冲液平衡，将脱盐后的球蛋白溶液加于DEAE纤维素阴离子交换柱上，用同一缓冲液洗脱，分部收集，检查洗脱蛋白质的分布情况（装柱、上
8、样、洗脱、收集及蛋白质检查等操作步骤有关注意事项同上）。精品.【实验结果】一、纯度鉴定采用醋纤膜电泳法。样品三个：（1）血清。（2）葡聚糖凝胶G25脱盐球蛋白液。（3）DEAE纤维素阴离子交换柱纯化的球蛋白液（由于此溶液浓度较低，应多次点样，每次点样时待干后再点，共约点1520l）。电泳及染色：方法同醋酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白实验，比较样品的电泳结果。二、定量检测1.用双缩脲法定量血清总蛋白，盐析出的球蛋白总量，计算A/G值。还可测定脱盐前后球蛋白总量，计算球蛋白盐析收得率，观察脱盐对球胆白收率究竟有无影响。2.用Lowry,s法定量DEAE柱各分部收集管中的球蛋白含量，制作球蛋白洗脱图，
9、并讨论其意义。3.可对两种定量方法做平行对照测定，讨论这两种方法适用价值【注意事项】1.勿使盐析中发生共沉。为此加饱和(NH4)2SO4时每滴不宜大，速度不宜快，边加边搅动。2.严格按柱层析的装柱、上样的技术要求，装好G-25柱，上好待脱盐的盐析球蛋白液；装好DEAE柱，上好待分离纯化球蛋白的脱盐球蛋白液。3.脱盐流速不宜过快，一般0.5ml/M为宜。4.pH6.3是DEAE离子交换层析柱从样品球蛋白中截留和球蛋白，放行球蛋白，致使球蛋白得以分离纯化的关键pH，必须调配准确。5.Nesseler试剂是检查球蛋白盐析液通过G-25柱的流出液中有没有NH4+，何时才有NH4+的试剂，事关脱盐效果。
10、该试剂的酸碱度对检察的准确性和灵敏度甚为重要。为此，可用该试剂滴定精品.20ml、 mol浓度的标准HCl，从其耗量（即滴定值）评价其酸碱度。具有最适酸碱度的Nesseler试剂，对20ml标准HCl的耗量在1111.5ml。若耗量超出11.5ml说明该试剂偏酸，显色偏浅，测试将出现假阴性；如消耗低于9.5ml，试剂偏碱，显色偏深，乃至出现红色沉淀，测试结果会出现假阳性。若遇上述情况可用无Na2CO3的10%的NaOH溶液或molHCl进行调试。6.应选择快速、灵敏定性检测方法和准确可靠的定量检测方法，设置足够数量的质量监控点，监控脱盐和球蛋白的分离纯化与洗脱分布情况。【技术意义】1.蛋白质的分离和纯化是研究蛋白质化学及其生物学功能的前提和基础。2.血清球蛋白的分离与纯化涉及到生物化学和相关学科的多种技术的配套使用。3.本实验涉及到质量控制和效益分析，使培养贴近实用、强化能力。如有侵权请联系告知删除，感谢你们的配合！精品