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1、.姓名：郭沈杰年级专业 ：2012 级生物科学同组者：蔡萍萍学号： 12050011012实验七酵母 RNA 的提取及鉴定一、实验目的掌握稀碱法提取酵母RNA 的原理和方法。二、实验原理酵母核酸中RNA 含量较多， DNA 含量则少于2% 。RNA 可溶于碱性溶液，当碱被中和后，可加乙醇使其沉淀，有此可得粗RNA 制品。用碱液提取的RNA 有不同程度的降解。三、实验仪器1 、离心机2 、水浴锅3 、电炉4 、烧杯5 、量筒6 、移液管7 、玻璃棒8 、滤纸9 、漏斗;.10 、试剂瓶11 、电子天平12 、 pH 试纸（ pH114 ）四、实验试剂1 、干酵母粉2 、 0.2% 氢氧化钠溶液：
2、2g 氢氧化钠溶于蒸馏水并稀释至1000ml 。3 、乙酸（ A.R. ）4 、 95% 乙醇5 、 无水乙醚（ A.R. ）6 、 10% 硫酸：浓硫酸（比重1.84 ） 10ml ，缓缓倾于水中，稀释至100ml 。7 、氨水（ A.R. ）8 、 5% 硝酸银溶液： 5g 硝酸银溶于蒸馏水并稀释至100ml ，贮于棕色瓶中。五、实验步骤( 一)RNA的提取 ：1 、称取 2g 干酵母粉于100ml烧杯中， 加入 0.2% 氢氧化钠溶液10ml ，沸水浴加热30分钟，经常搅拌（如沸水浴过程中溶液蒸干可再加58ml氢氧化钠）。冷却，然后加入乙酸数滴， 使提取液呈酸性（ pH 试纸检验， pH
3、56），离心 10-15分钟（ 4000r.p.m）。倒取上清液，加入2 倍体积的 95% 乙醇，边加边搅，加毕，静置，待完全沉淀，过滤。2、滤渣先用 95% 乙醇洗 2 次，每次约 5 毫升，再用无水乙醚洗2 次，每次也约 5ml 。3、洗涤时可小心地用玻璃棒搅动沉淀。乙醚滤干后，滤渣即为粗RNA ，可鉴定和测定;.含量用。（二）鉴定：1、取上述 RNA 约 0.5g ，加 10% 硫酸 5ml, 加热至沸 12 分钟，将 RNA 水解。2、水解液 2ml ，加入氨水 2ml和 5% 硝酸银溶液 1ml ，观察是否产生絮状嘌呤银化合物。注意事项：1 、离心管回收2 、离心的时候，要两两对称放
4、置，且离心管中溶液的量基本一样。否则会遭成离心机转子的损坏。六、实验结果( 一)RNA的提取：加入乙酸使溶液呈酸性，溶液呈土黄色。进行离心后，沉淀沉于离心管的下部，上半部分上清液呈土黄色。;.取上清液，加入2 倍体积的 95% 乙醇后，溶液呈现白色浑浊状完全浑浊后，上清液呈白色，沉淀为白色。;.过滤洗涤后，得RNA 粗品。（二）鉴定：（1 ）水解后，溶液呈无色透明状。;.加入氨水后，溶液仍澄清，溶液中似有油状物质产生。加入硝酸银后，仍似有油状物质产生。;.一段时间后，产生白色絮状沉淀。（2）取水解液0.5ml ，加苔黑酚三氯化铁试剂1ml ，加热至沸1min ，观察颜色变化;.七、实验分析称取
5、干酵母粉：2.0096g最后得到的RNA 粗品： 0.034 gRNA 提取率（ % ） =RNA质量（ g ）/ 干酵母粉质量（g ） x100%本实验中RNA 提取率（ % ）= 0.0346 g / 2.0096g = 1.722%（稀碱法提取的RNA 为变性 RNA ）本实验为定性实验，提取酵母中的RNA 中，产生白色沉淀时可能因副反应产生的其他沉淀，即最终的沉淀中可能混有其他杂质，不适于进行定量测定。依据：酵母细胞富含核酸，且核酸主要是RNA ，含量为干菌体的2.67%10.0%，而 DNA含量较少，仅为0.03%0.516%。为此提取RNA 多以酵母为原料。工业上制备RNA 多选用
6、低成本、 适于大规模操作的稀碱法或浓盐法。这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA ，主要用作制备单核苷酸的原料，其工艺比较简单。;.八、实验注意事项1. 过滤时 , 洗涤不能带水 , 否则沉淀粘在滤纸上取不下来。2. 有时絮状沉淀出现较慢 , 可放十多分钟。3. 利用等电点控制RNA 析出时，应严格控pH 。4. 稀碱法提取的 RNA 为变性 RNA ，可用于 RNA 组分鉴定及单核苷酸制备，不能作为RNA 生物活性实验材料。九、思考题? 1 、简述核酸分离纯化的一般原则。保持核算一级结构的完整性；尽量排除其他分子的污染，保持核酸纯度。? 2 、 RNA 提取过程中的关键步骤及注意事项有哪些？过滤时，洗涤不能带水，否则沉淀粘在滤纸上取不下来；有时絮状沉淀出现较慢，可放十多分钟；利用等电点控制RNA 析出时，应严格控制pH ；稀碱法提取的rna 为变性 rna ，可用于单核苷酸制备，不能作为rna 生物活性材料。;.