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1、通讯作者， ： 。 论 著 多重耐药肺炎链球菌差异 消减文库的构建及初步筛选 宋瑱 ， 熊 辉 ， 李 燕 ， 丁显平 （ 四川大学： 生命科学学院， 成都 ； 华西医院检验科， 成都 ， 成都中医药大学医学技术学院 ） 摘要： 目的比较肺炎链球菌多重耐药株与敏感株标准参考菌之间的差异基因。方法使用抑制性消减杂交技术构建多 重耐药肺炎链球菌差异 消减文库， 经斑点杂交筛选阳性克隆后对部分 片段进行测序和同源分析。结果成功的构建 了肺炎链球菌多重耐药株差异 消减文库， 经斑点杂交的初步筛选， 有 个仅能与多重耐药株 探针杂交， 而不能与敏 感株 探针杂交。对这 个克隆片段测序及基因库检索分析，
2、发现个未知新序列。结论从全基因角度研究肺炎链球菌 多耐药菌株与标准菌株基因组 分子遗传差异， 为发现、 克隆肺炎链球菌多重耐药相关基因提供依据。 关键词： 序列分析；抗药性， 多药； 肺炎链球菌；抑制消减杂交；消减文库 ： 文献标识码：文章编号： （ ） ， ， ， （ ， ， ， ； ， ， ， ， ； ， ， ， ） ： （ ） ， ， ， ， ， ， ： ； ， ； ； ； 肺炎链球菌是社区获得性感染的常见疾病如肺炎、 中耳 炎、 脑膜炎、 败血病等的主要病原体 。近年来， 肺炎链球菌对 青霉素和大环内酯类抗菌剂表现出很高的耐药性， 并呈现逐年 上升的趋势， 而且出现对其他抗菌剂（ 如喹
3、诺酮类抗菌剂等） 的 多重耐药性 。为了探讨肺炎链球菌多耐药的分子机制， 本 研究以临床分离的肺炎链球菌多耐药菌株和抗生素敏感的标 准菌株为研究对象， 选用了抑制消减杂交技术从全基因水平对 肺炎链球菌多重耐药机制进行研究。 材料与方法 材料 菌株与质粒肺炎链球菌多重耐药菌株 分 离自四川大学华西医院， 多重耐药株 分离自四川省第 五人民医院。法药敏试验结果显示对阿奇霉素、 四环素、 克林霉素、 氯霉素、 复方磺胺甲噁唑均耐药。肺炎链球菌标准 菌株 由四川大学华西医院微生物实验室提供， 为 上述抗菌剂敏感株。 线性 质粒购自北京全氏 金公司。 试剂 选择性细菌基因组消减试剂盒购自 公 司， 地高
4、辛探针标记试剂盒购 自 公 司， 、 购自 公司。 相对分子质量标准、 聚合酶、 三磷酸脱氧核糖核苷 （ ） 、 聚合酶、 多功能 回收试剂盒、 柱式质粒 提取 试剂盒均购自博迈德公司。测序在北京博迈德公司进行。实 验中所用接头及引物见表。 方法 抑制性消减杂交构建多重耐药肺炎链球菌差异 消减文库采用 选择性细菌基因组消减试剂盒， 原理详 见参考文献 按说明书方法进行。被检菌（ ） 为多耐 药菌株 ， 基因组 ， 参考菌（ ） 为标准 菌株 基因组 。采用 法提取细 菌基因组 。将被检菌基因组 经 酶切后分成 两份分别连接接头、 接头 ， 然后分别以两种连接产物为模 板， 以 引物检查接头连接
5、效率。接头连接后取出 连接有接头、 接头 的样品混合作为未消减对照待用。 第轮杂交： 接有两种接头的被检菌 片段分别与酶切后 过量的参考菌 片段在 变性 、 杂 交 国际检验医学杂志 年 月第 卷第 期 ， ， ， ， 立即进入第轮杂交。两组第轮杂交体系混合后加 入过量的变性后参考菌 片段， 杂交过夜。以稀释后 第轮杂交产物为模板， 用接头外侧引物（ 引物） 进行第 次 扩增。以第次 稀释后产物为模板用巢式引物 和巢式引物 进行第次 扩增， 同时进行 产物 消减效率 检 测。将 上 一 步 得 到 的 第 次 产 物 经 柱 式 回收试剂盒回收纯化后， 与 线性化 质粒 进行连接反应， 连接产
6、物转化 感受态细胞， 通过含 、 异丙基硫代吡喃半乳糖苷（ ） 的氨苄西林 平板筛 选阳性克隆， 建立消减文库。 表 接头和引物序列 接头及引物序列 接头 接头 引物 巢式引物 巢式引物 上游引物 下游引物 基因组 消减文库的初步筛选及鉴定阳性克隆 随机挑选 个白色菌落。以巢式引物和巢式引物 进行 菌落 初步鉴定阳性克隆。斑点杂交： 取 消化的耐 药株和 株基因组 ， 用地高辛标记试剂盒进行探针 标记。然后将被检菌消减文库克隆的质粒 经变性后点 到硝酸纤维膜上， 固定 ， 进行预杂交和杂交。最 后经 检测试剂盒显色。 测序将斑点杂交鉴定后的 个阳性克隆以 ， 为 引 物 进 行 双 向 测 序
7、， 测 序 结 果 在 中 进 行 检索分析。 结果 基因组 酶切质量分析将经过 酶酶切 过后的 产物和的未酶切 的肺 炎 链 球 菌 基 因 组 进行 的琼脂糖凝胶电泳。未酶切的基因组 在 左右， 酶酶切后的产物带呈弥漫性条带在 左右。酶切效果良好， 可以进行后续实验， 见 图。 ： 未酶切的基因组 ；： 相对分子质量标准 、 、 、 、 、 ；： 酶切后的基因组 。 图基因组 提取及 酶切结果 接头连接效率、 消减效率及 结果将 酶酶切 的被检菌 分别与接头和接头 连接后， 按试剂盒方 法以 引物做 检查接头连接效率。连有接头与 未连接头的 基因的荧光强度相差之比小于倍， 说 明连接效率大
8、于 ， 结果符合要求。连接有接头的被检菌 与参考菌 进行两轮消减杂交和两轮 后得到消 减后富集了差异片段的 产物。电泳结果出现弥散分布 带， 大小 ， 其中有明显富集的条带（ 图） 。消减 效率检测分析， 以 管家基因在抑制性消减杂交产物 中的丰度为参考， 通过电泳条带的荧光强度检测显示， 消减后 的 产物相对于未消减的 产物明显减少， 说明消减效 率符合要求， 见图。 ： 肺炎链球菌多重耐药菌株 第次 结果； ： 多重 耐药株 第次 结果；： 相对分子质量标准 、 、 、 、 、 。 图 抑制消减杂交结果 消减文库构建及初步筛选结果纯化回收第次 产物后取和 载体连接后转化 感受 态细胞， 经
9、蓝白斑筛选的消减文库。直径大于的白色菌 落约 个， 约占蓝白菌总数的 。随机挑取 个白色 克隆， 用巢式引物和巢式引物 进行 后有 个克隆 能扩增 出 大 小 的 单 一 片 段， 阳 性 克 隆 率 达 国际检验医学杂志 年 月第 卷第 期 ， ， ， 。 斑点杂交分析结果随机挑选的 个白色菌落经碱裂 解法制备质粒， 每个质粒变性后印迹到两张硝酸纤维膜同一位 置上。分别与经地高辛标记的 酶酶切后的被检菌和参 考菌 探针杂交。结果发现 个仅能与被检菌即多重耐 药株 探针杂交， 而不能与参考菌即敏感株 探针杂 交， 见图。 以消减的第轮 产物（） 和未消减的对照（） 为模板， 用 上下游引物扩增
10、；、： 次循环产物； 、： 次循环产物；、： 次循环产物；、： 次循环产物。 图消减效率检测结果 白色圆圈： 被检菌即多重耐药菌特有的克隆。 图斑点杂交差异分析结果 序列分析及初步结果将上述 个阳性克隆菌落送博 迈德公司测序部测定其序列， 将测得的序列在基因库中进行 比对， 查找同源序列。其中株未发现其同源或是相 匹配的基因， 说明可能发现了个和多重耐药相关的新的肺炎 链球菌 片段。 讨论 近年来， 肺炎链球菌对抗生素的耐药研究主要集中在介导 青霉素耐药的 基因和介导红霉素耐药 基因上。但肺 炎链球菌耐药菌株中与多重耐药相关的基因尚不明确。因此， 在全基因水平上筛选肺炎链球菌多重耐药相关基因进
11、行研究， 有助于探讨肺炎链球菌多重耐药的分子机制； 新发现的可能与 耐药相关的基因为后续的研究提供实验依据。 抑制消减杂交技术是一种基因差示筛选方法， 它将消减杂 交与 结合， 可凭表型直接分离基因， 目前已成为分离未知 新基因的主要方法。此方法通过两次杂交、 两次 后经 克隆建立消减文库可以可同时分离上百个差异基因， 程序相对 简单， 不需要特殊的昂贵仪器， 操作简便易行 。目前， 抑制消 减杂交技术主要应用在肿瘤基因差异基因表达谱的筛选。经 等 对抑制消减杂交技术进行改良， 用于细菌基因 组比较分析， 为病原体中未知基因的筛选、 细菌致病性和种属 进化研究提供了重要的技术手段。 参考文献
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