分子生物学期末复习.doc

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1、染色体与DNA 1 值：最大C值：一种生物单倍体基因组DNA的总量。最小C值：编码基因信息的DNA总量。2 值矛盾：生物的C值（或基因组的大小）并不与生物复杂程度相关的现象。3 卫星DNA：高度重复的DNA序列，A、T含量较高，不编码基因，无选择压力，高度特异性4 重叠基因：同一段DNA能携带两种不同的蛋白质信息。如X174，SV40病毒，G4噬菌体的DNA中。重叠的方式：1、大基因之内包含小基因 2、前后基因产生首尾重叠 3、三个基因的三重重叠 。重叠的种类：反向重叠基因、同向重叠基因、异向位重叠基因、同向位重叠基因重叠基因的生物学意义：1) 原核生物进化的经济原则(较小的C值编码较多的基因

2、信息) 2) 遗传信息量的估算增加 3)提高蛋白质的疏水性，以增加生物体自然选择的适应性 4) 丰富和发展了基因的概念5 Tm值：OD增加值的中点温度Tm = 69.3 + 0.41 GC%影响 Tm值的因素:1. 在 A, T, C, G 随机分布的情况下， Tm与GC%成正比关系, GC%含量相同的情况下，AT形成变性核心（分布相对集中），变性加快，Tm 值小 2、碱基排列对Tm值具有明显影响3、片段长短对Tm值的影响4、 变性液如尿素，酰胺，甲醛等对Tm值的影响5、盐浓度的影响 6、极端pH条件的影响6 复制子（Replicon）：DNA复制从起点开始双向进行直到终点为止，每一个这样的D

3、NA单位称为复制子或复制单元。7 复制叉（replication fork）：正在进行复制的双链DNA分子所形成的Y形区域。8 冈崎片段：刚开始合成的片段都是小片段，以后在连接成长片段，短片段称冈崎片段。9 前导链：以复制叉移动的方向为基准，条模板链是35，以此为模板而进行的新生DNA链的合成沿53方向连续进行，这条链称为前导链（leading strand）。10 后随链：以复制叉移动的方向为基准，条模板链的方向为53，以此为模板的DNA合成也是沿5一3方向进行，但与复制叉前进的方向相反，而且是分段、不连续合成的，这条链称为后随链（laggingstrand）。11 酶：E.coli DNA

4、聚合酶I经胰蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶部分水解生成的C末端605个氨基酸残基片段。12 端粒酶：是使端粒延伸的反转录DNA合成酶，是由RNA和蛋白质组成的核糖核酸蛋白复合物。13 AP位点：能特异性切除N-糖苷键，在DNA上形成去嘌呤，或去嘧啶位点，故称AP位点。14 DNA转座：(移位)，是由可移位因子介导的遗传物质重排现象。15 P转座子（P element)：是果蝇中诱发杂种不育转座子P果蝇体细胞中：一种胞质因子结合外显子3，导致内含子3不能被顺利切除，这种mRNA的翻译产物能阻止P元件的转移。P果蝇雄配子与M雌配子结合成合子后，合子中不存在胞质因子，所以内含子全部切除，这种mRNA的翻译产

5、物即转座酶，P元件发生频繁转座，导致基因插入失活，引起生殖障碍。P品系体细胞中，阻遏蛋白阻止P元件的第3个内含子的剪接，转座酶不能产生。P品系生殖细胞中，P元件的4个外显子剪接在一起，产生转座酶。16 引发酶：一种依赖于DNA的RNA聚合酶，其功能是在DNA复制过程中先合成一段RNA引物，在这引物上延伸新合成的DNA片段。不同于在DNA转录中起作用的RNA聚合酶。17 引发末端（引物，primer）：由引发酶在DNA模板上合成一段RNA链，提供的RNA片段。18 DNA聚合酶：以单链或双链DNA为模板，催化由脱氧核糖核苷三磷酸合成DNA的酶。在原核细胞有DNA聚合酶、。真核生物中有DNA聚合酶

6、、五种，其中为主要的聚合酶，存在于线粒体中。19 真核细胞DNA序列分为：高度重复序列：不编码基因 ，无选择压力，高度特异性。 中度重复基因：拷贝重复，多量，序列多相似，排列成束，具有进化整体性，积累突变。 不重复序列：多为结构基因20 原核细胞DNA结构特点：结构简练，无冗余序列，由一个DNA分子组成；存在转录单元，功能相关的基因都串联在一起组成操纵子，转录产物为多顺反子；有重叠基因。21 真核细胞DNA结构特点：单顺反子，割裂基因，内含子22 Z-DNA：1、主要特点：主链中各个磷酸根呈锯齿（Zigzag）状排列，因此称Z-构象 ；Z-构象中的重复单位是二核苷酸；嘌呤与嘧啶交替排列 ；Z-

7、DNA只有一个螺旋沟，它相当于B构象中的小沟，它狭而深，大沟则不复存在。 2、Z-DNA存在的条件：高盐的条件下：NaCl的浓度超过2mol/L，MgCl2的浓度要超过0.7mol/L； 嘌呤-嘧啶相间排列：poly d(GC)n。一般不少于6个bp的嘌呤-嘧啶交替排列顺序 ；在活细胞中如果胞嘧啶被甲基化的（m5C）则无需嘌呤-嘧啶相间排列，在生理盐水的浓度下就可产生Z型 ；体内负超螺旋的存在也是Z-DNA形成的条件之一 ；在体内有多胺化合物的存在，如精胺、亚胺和亚精胺，它们和阳离子一样，可和磷酸基团结合，减少负电荷的排斥作用，使B-DNA转变成Z-DNA。 23 半保留复制DNA在复制过程中

8、，首先是两条互补配对的链间的氢键断裂并使双链解旋和分开，然后以每条链为模板，仍然按照碱基互补配对原则，由DNA聚合酶催化合成新的互补链，结果由一条双链复制成两条双链分子，所形成的两个DNA分子与原来的DNA分子的碱基序列完全相同：在此过程中，每个子代双链的一条链来自亲代DNA，另一条链则是新合成的，这种复制方式称为半保留复制（Semiconservative replication）24 半不连续复制 DNA复制的最主要特点是半保留复制，另外，它还是半不连续复制。DNA双螺旋的两条链是反向平行的，因此，在复制起点处两条DNA链解开成单链时，条是53方向，另一条是35方向。随着双链的打开，新生链

9、延伸方向一条为3一5，另一条为53。但生物细胞内所有催化DNA合成的聚合酶都只能催化53延伸，这是一个矛盾。冈崎片段的发现使这个矛盾得以解决。在复制起点两条链解开形成复制泡，DNA向单侧或两侧复制形成一个或两个复制叉（replication fork）。以复制叉移动的方向为基准，条模板链是35，以此为模板而进行的新生DNA链的合成沿53方向连续进行，这条链称为前导链（1eading strand）。另条模板链的方向为53，以此为模板的DNA合成也是沿5一3方向进行，但与复制叉前进的方向相反，而且是分段、不连续合成的，这条链称为滞后链（1aggingstrand），合成的片段即为冈崎片段。这些冈

10、崎片段以后由DNA连接酶连成完整的DNA链。这种前导链的连续复制和滞后链的不连续复制在生物中是普遍存在的，称为DNA合成的半不连续复制。25 线性DNA末端复制子末端的复制：利用末端蛋白的Ser-OH，形成TP-dNTP作为引物；通过形成连环分子（串联体）重新切割避免末端萎缩；将线性DNA暂时转变为环状DNA；滚环复制。26 环状DNA双链的复制：1.型 eg：E.coli oriC起始的复制，复制是双向等速的2.滚环复制复制、共价延伸方式，是单向复制的特殊方式。如：X174 phage RF型 DNA， phage，F质粒 3.D-loop复制（D-环复制）：也是单向复制的一种方式。如：动物

11、线粒体（mtDNA）27 转座：原核生物：1、插入序列（IS）：长约1kb；是原核生物的正常组分：F质粒；两端为反向重复（IR）；存在ORF，仅编码转座酶等与转座相关的蛋白，无表型效应（无可鉴定的遗传标记）；IR介于15-25bp，且IR序列高度相关，但通常不完全一致。2.复合转座元（Tn）：由抗性基因与两侧的IS或类IS构成；通常IS序列或类IS序列，可以相同，也可以不同，其碱基差异可能为中心序列提供所需相关序列。多数只有一个具有转座活性；IS序列或类IS序列在Tn两端呈IR或DR排列；中心序列：编码抗药性基因，调节基因，如四环素抗性基因3.TnA家族（Tn3）：无IS，两端为小的IR序列（

12、3738bp）；中心序列含有转座酶和抗性基因编码区；其转座相关的酶作用是反式（前两类是强烈顺式作用），表现为区域优先；序列较长5000bp。真核生物：1.玉米中的转座因子：存在形式成对出现、结构上类似于IS，Ac：全长4.5kb，产生3.5kb的mRNA。AS-DS系统:AS 激活因子，自主原件；DS 解离因子，非自主原件Spm-dSpm系统两端均为11bp的完美倒转序列，靶位为8bp DRDc：长度不定，0.44kb2.果蝇中的可转移因子：P原件组成：1.全长2907bp；2.IR为31bp（无论是完整P成分，还是缺失的P成分）；3.RF含有3个内含子，4个外显子，每个外显子构成1个ORF转

13、录1、转录：是指拷贝出一条与DNA链序列完全相同的RNA单链的过程。2、有义链（编码链）：与mRNA序列相同的那条DNA链。3、反义链（模板链）：根据碱基互补配对原则知道mRNA合成的DNA链。4、不对称转录：某一基因只以一条单链DNA为模板进行转录。5、RNA转录基本过程：1）模板识别：RNA聚合酶与启动子DNA双链相互作用并与之结合的过程。 2）转录起始：RNA链上第一个核苷酸键的产生 3）转录延伸：RNA聚合酶释放因子离开启动子后，核心酶沿模板DNA链移动并使新生RNA链不断伸长的过程。4）转录终止：在终止子处停止转录、流产式转录：一般情况下，新生RNA的三元复合物可以进入两条不同的反应

14、途径：一是合成并释放29个核苷酸的短RNA转录产物，即所谓的流产式起始。7、真核细胞RNA聚合酶：RNA聚合酶所合成的RNA（前体）分布IIIIIIrRNA(5.8s,18s,28s )mRNA/snRNAtRNA,5sRNA核仁核质核质8、原核细胞RNA聚合酶：亚基基因相对分子量亚基数组分功能rpoA365002核心酶核心酶组装，启动子识别rpoB1510001核心酶和共同形成RNA合成的活性中心rpoC1550001核心酶和共同形成RNA合成的活性中心？110001核心酶？rpoD700001因子存在多种因子，用于识别不同的启动子，增加酶与DNA的亲和力参与终止转录9、启动子：指能被RNA

15、聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。TATA区：酶的紧密结合位点（富含AT碱基，利于双链打开） TTGACA区：提供了RNA聚合酶全酶识别的信号，酶的结合位点10、上升突变： 增加Pribnow区共同序列的同一性。11、 下降突变：降低结构基因转录水平的启动子突变，如：Pribnow区的TATAAT变成AATAAT。12、 原核生物mRNA的特征：半衰期短，多以多顺反子的形式存在，5 端无“帽子”结构， 3 端没有或只有较短的poly（A ）结构。13、 SD序列：mRNA中用于结合原核生物核糖体的序列。 14、 真核生物mRNA的特征：5 端存在“帽子”结构，多数mRNA 3 端

16、具有poly（A ）尾巴（组蛋白除外），以单顺反子的形式存在。15、 终止子： 不依赖r因子的终止：终止位点上游一般存在一个富含GC碱基的二重对称区，RNA形成发夹结构；在终止位点前面有一段由4-8个A组成的序列，RNA的3端为寡聚U 依赖r因子的终止：r因子：六聚体蛋白、水解各种核苷三磷酸促使新生RNA链从三元转录复合物中解离出来，从而终止转录。16、 通读（抗终止，readthrough）：转录过程中有时即使遇到终止信号，仍然需要继续转录的现象。 破坏终止位点RNA的茎环结构弱化机制依赖于蛋白质因子的转录抗终止：N蛋白17、 类内含子的自我剪接：（无明显边界序列）1、游离鸟苷酸发起第一次转

17、脂反应 2、外显子发起第二次转脂反应。18、 类内含子的自我剪接：1、分支点A发起第一次攻击 2、上游外显子发起第二次攻击19、 mRNA的加工(真核生物)：5端加帽，3端加尾，RNA的剪接，RNA的编辑。20、 核酶：（Ribozyme RNA）：有酶活性的RNA（ RNA性质的酶）。 翻译1、 密码子：mRNA上每3个核苷酸翻译成蛋白质多肽链上的一个氨基酸，这3个核苷酸就称为密码子。2、 移码突变：在基因编码区，核苷酸插入或缺失导致三联体密码子阅读方式的改变，从而使该基因的相应编码序列发生改变。3、核糖体结合技术：特定三核苷酸为模板 + 核糖体 + 20 种AA-tRNA (其中一种AA-

18、tRNA的氨基酸被14C标记） 保温 硝酸纤维滤膜过滤 分析留在滤膜上的核糖体-AA-tRNA 确定与核糖体结合的AA和模板4、遗传密码性质：简并性与兼职性：简并性：许多氨基酸对应的密码子不止一种。兼职性： AUG（Met)和GUG（Val)两个密码子除代表特定氨基酸外，还兼作起始密码子。普遍性与特殊性：普遍性： 遗传密码无论在体内还是体外，无论是对病毒、细菌、动物还是植物而言都通用；特殊性：遗传密码的个例很少见；基因组中编码含义的改变常涉及到对终止密码子的解读；密码子系统性改变只存在于线粒体中。 密码子-反密码子识别的摆动性：在密码子与反密码子的配对中，前两对严格遵守碱基配对原则，而第三对碱

19、基有一定的自由度，可以“摆动”。读码的连续性：生物合成过程中，mRNA的编码方向是53，从N端向C端延伸肽链。一条肽链合成起始后，密码子按3个一框读下去不重叠也不跳格，直到终止。5、摆动假说：在密码子与反密码子的配对中，而第三对碱基有一定的自由度，可以“摆动”。6、同工tRNA：几个代表相同氨基酸的tRNA称同工tRNA。7、无义突变(nonsense mutation): 指DNA上任何代表氨基酸的密码子变为终止密码子的改变。8、错义突变 (missense mutation): 指DNA分子中的核苷酸置换后改变了mRNA上遗传密码，从而导致合成的多肽链中一个氨基酸被另一氨基酸所取代的改变。

20、9、同义突变（synonymous mutation）：编码同一氨基酸的密码子的核苷酸改变但不改变编码的氨基酸，即不改变基因产物的突变。10、起始tRNA和延伸tRNA：一类能特异识别mRNA模板上起始密码子的tRNA叫起始tRNA；其它tRNA称为延伸tRNA。11、核糖体有五个tRNA结合位点： 1）mRNA结合位点：与转录来的信使RNA相结合。2）5S RNA位点：与核糖体小亚基（5SRNA)的结合位点。注意：核糖体其实是两个亚基结合起来的，小的叫小亚基，大的叫大亚基。通常，两个亚基是分开的，只有当开始翻译的时候才互相结合。 3）氨酰-tRNA进入A位（除用于起始的那个） 4）肽酰-tR

21、NA和起始氨酰-tRNA进入P位 5）去氨酰-tRNA通过E位脱出12、多核糖体：多个核糖体串在同一个mRNA上，同时进行翻译。13、细菌中的三种起始因子IF-1：与30S亚基结合在A位，阻止氨酰-tRNA进入；阻止30S与50S亚基结合。IF-2：结合特定起始因子tRNA，控制它进入核糖体；有核糖体依赖GTP酶活性；IF-3：稳定30S亚基；辅助30S亚基与mRNA上起始点特异性结合；14、原核生物RF：I型释放因子（RF1识别UAA和UAG，RF2识别UGA和UAA）II型释放因子(RF3)依赖GTP发挥作用，它协助I型因子，是激活因子。15、蛋白质前体加工：1、切除（信号肽，非功能片段）

22、，2、折叠（二硫键形成，三级结构）3、修饰（特定氨基酸）4、辅基的加入16、分子伴侣：能够在细胞内辅助新生肽链正确折叠的蛋白质，它本身并不参与蛋白质的形成。17、信号肽：在翻译过程中复责多肽插入内质网膜的一段氨基酸序列（通常在N端）18、信号肽假说：蛋白质合成后的靶向输送原理， 有几种不同的学说，信号肽假说是目前被普遍接受的 学说之一。分泌性蛋白质的初级产物 N-端多有信号肽结构，信号肽一旦合成（蛋白质合成 未终止） ，即被胞浆的信号肽识别蛋白（SRP）结合，SRP 与内质网膜的内侧面的受体即对接 蛋白（DP）结合，组成一个输送系统，促使膜通道开放，信号肽带动合成中的蛋白质沿通道 穿过膜， 信

23、号肽在沿通道折回时被膜上的信号肽酶切除， 蛋白质在内质网和高尔基体经进一 步修饰（如糖基化）后，即可被分选到细胞的不同部位。原核生物基因表达调控1、负转录调控：一些operon被调节蛋白结合后表达受到阻遏，这类调节蛋白即repressor，这种调控方式即negative control.2、正转录调控：有些operon被调节蛋白结合后表达开启，这类调节蛋白即诱导蛋白（activator），这种调控方式即positive control。3、可诱导调节：一些基因在特殊的代谢物或化合物的作用下，由原来关闭的状态转变为工作状态，即在某些物质的诱导下使基因活化。4、可阻遏调节：这类基因平时都是开启的，

24、处在产生蛋白质或酶的工作过程中，由于一些特殊代谢物或化合物的积累而将其关闭，阻遏了基因的表达。5、乳糖操纵子：1）CRP对lac-o的正调控： 当Glucose充足时，其分解物抑制腺苷酸环化酶活性（降解物阻遏， Catabolite Repression ），此时cAMP浓度不高，CRP无法与cAMP结合，则不能与lac-o的CAP位点结合，此时operon的转录无法起始； 当Glucose不足时，腺苷酸环化酶催化AMP形成cAMP，CRP结合cAMP后与CAP位点结合激活operon的转录。 因此：lac-o的转录需要有lactose，同时Glucose必须处于低浓度许多糖类都存在这种代谢物

25、阻遏，细菌先利用容易利用的碳源，二次生长的出现。3）lac-o的突变效应 lacIS 阻遏蛋白不可诱导性突变，阻遏蛋白失去诱导物结合位点superrepressed/uninducible lacI- 阻遏蛋白不能形成寡聚物 lacI-d 阻遏蛋白不能和DNA结合，且呈负互补(反式显性) Oc 操纵基因的组成型突变 4）lac-o的应用：用作报告基因（筛选标记） 培养基中存在IPTG 和X-gal （5-溴-4-氯-3-吲哚-半乳糖苷 ）时， -半乳糖苷酶能分解X-gal产生蓝色 （互补）而重组子由于基因插入使肽基因失活，不能形成互补，在含X-gal的平板上，含阳性重组子的细菌为无色菌落或噬菌

26、斑。 当空载载体进入受体细胞时，培养基呈蓝色 当载体重组了外源DNA片段时，进入受体细胞后培养基不呈蓝色6、安慰诱导物：一些诱导物的结构类似物也能产生诱导效应，这类物质不能作为编码产物的底物而被降解，称为安慰诱导物（gratuitous inducers ）7、互补： (1)质粒载体带有lacZ基因5部分，它编码半乳糖苷酶N-端的146个氨基酸，称为肽。 (2)载体转化的宿主细胞为lacZ15基因型，它表达半乳糖苷酶的C-端肽链。 (3)当载体与宿主细胞同时表达两个片段时，宿主细胞才有半乳糖苷酶活性，使特异的底物X-gal 变为兰色化合物，这就是所谓的互补.8、诱导物：调节蛋白存在小分子物质的

27、结合位点，有些小分子与调节蛋白（repressoractivator）结合后导致操纵子表达开启，这类小分子物质即诱导物；这类小分子物质通常是操纵子编码的酶的底物，可被降解。9、反义RNA micRNA（mRNA-interfering complementary RNA）：干扰mRNA的互补RNA，是指能与被调控的RNA或DNA互补的小分子RNA，通过碱基的互补配对与目标RNA或DNA形成双链复合物，影响RNA的修饰、翻译、转录等过程，封闭或抑制基因的正常表达。作用机制： 控制翻译起始 控制RNA的稳定性 控制转录的终止 另外：对复制的调控（chapter2：colE1质粒）10、 警报素（a

28、larmone）：ppGpp和cAMP这类物质称为警报素.11、严谨反应（ Stringent reponse）：是指细菌在不利的生长条件下自动减少tRNA和核糖体合成的能力 。11、 空转反应(Idling reaction) ：是指当核糖体A位点存在空载tRNA时产生pppGpp和ppGpp的现象。13、Attenuator ：一个受到翻译控制的转录终止子结构，由于翻译的影响，衰减子下游基因得以继续转录或在衰减子处终止而产生衰减作用。真核生物基因表达调控1、 基因家族：真核细胞中许多相关的基因常按功能成套组合，被称为基因家族。2、 超敏感位点：又称DNA酶I超敏感位点，活跃基因所在的染色质

29、上一般含有一个或数个又称DNA酶I超敏感位点，它们大多位于基因5端启动区。3、 CpG岛：基因组中长度为3003000 bp的富含CpG二核苷酸的一些区域，主要存在于基因的5区域。启动子区中CpG岛的未甲基化状态是基因转录所必需的，而CpG序列中的C的甲基化可导致基因转录被抑制。4、 反式作用因子：转录因子的结构：DNA结合结构域/转录活化结构域1 DNA结合结构域的类型1）Zinc finger（锌指），如甾醇类激素受体和一些转录因子； 2）Leucine zipper（亮氨酸拉链），如一些增强子结合蛋白；3）H-T-H（螺旋-转角-螺旋结构），如lamda-phage C I蛋白H-L-H

30、（螺旋-环-螺旋）如Ig增强子结合蛋白；4）同源域蛋白(homeo domain)最初发现于果蝇homeotic loci(一种控制果蝇幼虫体节分化的基因) 通常这些DNA结合结构域都是碱性的，能与电负性的DNA通过电荷作用增强结合作用2. 转录活化结构域结构：1）带负电的螺旋结构2）富含谷氨酰胺的结构3）富含脯氨酸的结构5、隐蔽mRNA：许多真核生物的卵细胞都贮藏着暂时不翻译的mRNA（不活跃的mRNA或隐蔽mRNA），在受精后几分钟，这些mRNA便开始翻译。6、招募因子：在受精前缺乏某些促进核糖体与mRNA结合因子，称为招募因子。7、DNA甲基化：甲基化的普遍性：5% C甲基化 CG二核苷

31、酸对（CpG岛）常发生甲基化：pCpm5CpGpGOHGATC的A的m6也容易发生甲基化： pGpApTpC 甲基化通常发生在卫星DNA上，单一序列也存在甲基化（组织特异性）m5C的功能: 1. 复制修复：新生链的非甲基化为修复系统提供识别标记 2. 关闭某些基因的表达（暂时或长期） 1）返祖现象：原来由于甲基化关闭的祖先基因通过去甲基化重新表达2）奢侈基因的出现：甲基化的组织特异性使某些基因只在特定组织中表达。 3） 肿瘤的出现：甲基化关闭抑癌基因的表达 4） 印迹基因的形成：在配子形成时出现差异甲基化区（DMR），导致后代具有某一亲本的突出特点 3. m5C 与基因突变的关系 形成突变热点

32、4. m5C-甲基化是生物自我保护的机制 5. m5C-使Z-DNA在体内趋于稳定状态 重复序列高度甲基化，单一结构基因很少甲基化 。8、限制、修饰：限制：实验表明，用（K）噬菌体感染大肠杆菌B菌株，形成噬菌斑的效率就很低，因此我们说（K）噬菌体受到了B菌体的限制。修饰：如此由第二个寄主菌株（大肠杆菌B株）赋予噬菌体的这种非遗传化，使得它再感染时能够有效地生长，而没有再次受到限制的现象，称之为修饰。无论是限制还是修饰，都是由寄主控制的，我们统称为寄主控制的限制与修饰现象 。寄主控制的限制与修饰现象由两种酶活性配合完成的，一种叫修饰的甲基转移酶，另一种叫核酸内切限制酶。寄主控制的限制与修饰的作用

33、 一是保护自身的DNA不受限制 二是破坏外源DNA使之迅速降解9、同裂酶，同尾酶：同裂酶（同位酶）：识别位点一样，但是切割位点（可能）不一样 同尾酶：产生相同的粘性末端，但是识别位点可能不一样 分子生物学技术1、蓝白斑筛选：是一种基因工程常用的重组菌筛选方法。 野生型大肠杆菌产生的-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。有色物质可以使整个培养菌落产生颜色变化，而颜色变化是鉴定和筛选的最直观有效的方法。 设计适用于蓝白斑筛选的基因工程菌为-半乳糖苷酶缺陷型菌株。这种宿主菌的染色体基因组中编码-半乳糖苷酶的基因突变

34、，造成其编码的-半乳糖苷酶失去正常N段一个146个氨基酸的短肽（即肽链），从而不具有生物活性，即无法作用于X-gal产生蓝色物质。用于蓝白斑筛选的载体具有一段称为lacz的基因，lacz中包括：一段-半乳糖苷酶的启动子；编码肽链的区段；一个多克隆位点(MCS)。MCS位于编码肽链的区段中，是外源DNA的选择性插入位点，但其本身不影响载体编码肽链的功能活性。虽然上述缺陷株基因组无法单独编码有活性的-半乳糖苷酶，但当菌体中含有带lacz的质粒后，质粒lacz基因编码的肽链和菌株基因组表达的端缺陷的-半乳糖苷酶突变体互补，具有与完整-半乳糖苷酶相同的作用X-gal生成蓝色物质的能力，这种现象即-互补

35、。 操作中，添加IPTG(异丙基硫代-半乳糖苷)以激活lacz中的-半乳糖苷酶的启动子，在含有X-gal的固体平板培养基中菌落呈现蓝色。以上是携带空载体的菌株产生的表型。当外源DNA（即目的片段）与含lacz的载体连接时，会插入进MCS，使肽链读码框破坏，这种重组质粒不再表达肽链，将它导入宿主缺陷菌株则无互补作用，不产生活性-半乳糖苷酶，即不可分解培养基中的X-gal产生蓝色，培养表型即呈现白色菌落。 实验中，通常蓝白筛选是与抗性筛选一同使用的。含X-gal的平板培养基中同时含有一种或多种载体所携带抗性相对应的抗生素，这样，一次筛选可以判断出：未转化的菌不具有抗性，不生长；转化了空载体，即未重

36、组质粒的菌，长成蓝色菌落；转化了重组质粒的菌，即目的重组菌，长成白色菌落。PCR：1.PCR技术基本原理 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA的变性：模板DNA经加热至93左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为

37、反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟，23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。2.反应特点1)特异性强 :PCR反应的特异性决定因素为： 引物与模板DNA特异正确的结合； 碱基配对原则； Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性； 靶基因的特异性与保守性。 其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的

38、结合(复性)可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。 2)灵敏度高 ：PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12)量级的起始待测模板扩增到微克(g=-6)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位)；在细菌学中最小检出率为3个细菌。 3)简便、快速 ：PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在24 小时完成扩增反应。扩增产物一般用

39、电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。 4)对标本的纯度要求低 ：不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测。2、 southern印迹杂交：（Southern blot）是研究DNA图谱的基本技术，在遗传病诊断、DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定

40、，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量。基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。由于核酸分子的高度特异性及检测方法的灵敏性，综合凝胶电泳和核酸内切限制酶分析的结果，便可绘制出DNA分子的限制图谱。但为了进一步构建出DNA分子的遗传图，或进行目的基因序列的测定以满足基因克隆的特殊要求，还必须掌握DNA分子中基因编码区的大小和位置。有关这类数据资料可应用Southern印迹杂交技术获得。 Southern印迹杂交技术包括两个主要过程：一是将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，即印迹（blotting）；二是固定于膜上的核酸同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。该技术是1975年英国爱丁堡大学的E.M.Southern首创的，Southern印迹杂交故因此而得名。