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1、实验一 微生物的形态和结构观察一、实验目的1、 掌握普通光学显微镜的正确使用方法；2、 掌握革兰氏染色法的原理及操作步骤；3、 在显微镜下观察细菌、酵母菌等的个体形态和结构。二、基本原理普通光学显微镜是由一组光学系统和支持及调节光学系统的机械系统组成。 普通光学显微镜是由一组光学系统和支持及调节光学系统的机械系统组成。机械系统包括镜座、镜臂、镜台、物镜转换器、镜筒及调节器等。镜座是显微镜的基座，使显微镜能平稳地放置在桌子上；镜台又称载物台，是放置标本的地方，镜台上有压片夹用以固定被检标本，标本移动器可使标本前后和左右移动，有的标本移动器带有游标尺，可指明标本所在位置；镜臂用以支持镜筒，也是移动
2、显微镜时手握的部位；镜筒是连接目镜和物镜的金属筒，镜筒上端插入目镜，下端与物镜转换器相接；物镜转换器安装在镜筒的下端，其上装有35个不同放大倍数的物镜，可以通过转动物镜转换器随意选用合适的物镜；调节器安装在镜臂基部，是调节物镜与被检标本距离的装置，通过调节粗、细螺旋便可清晰地观察到标本。 光学系统主要包括目镜、物镜、聚光镜和反光镜等，较好的显微镜有内光源。目镜一般由两块透镜组成，不同的目镜上刻有5、10和15等字符以表示该目镜的放大倍数；物镜是显微镜中很重要的光学部件，由多块透镜组成，根据物镜的放大倍数和使用方法的不同，分为低倍物镜（4、10和20）、高倍物镜（40和45）和油镜（90、95和
3、100）等。被检物体经显微镜的目镜和物镜放大后的总放大倍数是物镜的放大倍数和目镜放大倍数的乘积。 形态观察主要包括群体形态和个体形态观察两方面。细菌个体微小，且较透明，必须借助染色法使菌体着色，显示出细菌的一般形态结构及特殊结构，在显微镜下用油镜进行观察。根据细菌个体形态观察的不同要求，可将染色分为简单染色、鉴别染色和特殊染色。本实验主要观察微生物的个体形态，掌握在细菌学中广泛使用的重要鉴别染色法革兰氏染色法；通过此染色，可将细菌鉴别为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类。革兰氏染色有着重要的理论与实践意义，其染色原理是利用细菌的细胞壁组成成分和结构的不同。革兰氏阳性菌的细胞壁肽聚
4、糖层厚，交联而成的肽聚糖网状结构致密，经乙醇处理发生脱水作用，使孔径缩小，通透性降低，结晶紫与碘形成的大分子复合物保留在细胞内而不被脱色，结果使细胞呈紫色。而革兰氏阴性菌肽聚糖层薄，网状结构交联疏松，而且类脂含量较高，经乙醇处理后，类脂被溶解，细胞壁孔径变大，通透性增加，结晶紫与碘的复合物被溶出细胞壁，因而细胞被脱色，再经蕃红复染后细胞呈红色。三、仪器和药品仪器：显微镜 酒精灯 接种柄 接种环 洗瓶 载玻片 滤纸 镜油 擦镜纸 无菌水 烧杯药品：结晶紫 95%乙醇 草酸铵 碘 碘化钾 蕃红 二甲苯 降酚细菌（培养1824小时的斜面菌种）细菌 酵母菌等标本片。 草酸铵结晶紫染液：A液 结晶紫2.
5、0g，95%乙醇20mL；B液 草酸铵0.8g，蒸馏水80mL。将A和B充分溶解后混合静止24小时过滤使用。 革氏染液：碘1g ，碘化钾2g ，蒸馏水300mL。蕃红染液：2.5%蕃红的乙醇溶液10mL，蒸馏水100mL混合过滤。脱色液：95%乙醇。四、实验步骤（一）、显微镜的使用1、标本放置 下降镜台或升高镜筒，把标本片置镜台上，用载玻片夹夹牢。2、调焦 转动粗调节螺旋，升高镜台或下降镜筒，使低倍物镜的前端接近载玻片，在物镜上观察，可看到物像，然后转动细调节螺旋，使物像清晰。3、使用油镜 用低倍镜看到物像后，选择合适的视野，并把要观察的部位置于视野的中央；把孔径光阑开到最大，使与油镜的数值口
6、径相匹配，选择合适的照明；转动粗调节螺旋，使镜台下降或镜筒上升，在染色标本处滴加12滴镜油，转动物镜转换器，把油镜置镜筒下方；转动粗调节螺旋，使镜台上升或镜筒下降，让镜头的前端浸入镜油中。操作时要从侧面仔细观察，只能让镜头浸入镜油中紧贴着标本而避免让镜头撞击载玻片，导致玻片和镜头损坏；然后在目镜下进行观察，并缓慢地转动粗调节螺旋，使镜台下降或镜筒上升即可看到物像，再转动细调节螺旋使物像清晰。转动粗调节螺旋，使镜台下降或镜筒上升时，若油镜已离开油滴，必须重新进行上述操作；不得边在目镜上观察，边转动粗调节螺旋，使镜台上升或镜筒下降使镜头前端浸入油滴中，否则易使镜头撞击载玻片，损坏标本和镜头。4、
7、显微镜使用后的处置观察结束后，转动粗调节螺旋使镜台下降或镜筒上升，取出染色标本片，然后先用擦镜纸擦去油镜上的镜油，再用擦镜纸沾少许二甲苯擦去粘在油镜上的镜油，最后用擦镜纸擦净二甲苯；把镜头转成“八”字形，套入镜罩后放入显微镜柜中。（二）革兰氏染色1、 涂片取洁净的载玻片一张，将其在火焰上微微加热，除去上面的油脂，冷却，在中央部位滴加一小滴无菌水，用接种环在火焰旁从培养24小时的斜面上挑取少量菌体与水混合；烧去环上多余的菌体后，再用接种环将菌体涂成直径约1cm的均匀薄层。制片是染色的关键，载玻片要洁净，不得沾污油脂，菌体才能涂布均匀。注意初次涂片，取菌量不应过大，以免造成菌体重叠。2、 干燥 涂
8、布后，待其自然干燥。3、 固定 将已干燥的涂片标本面向上，在微火上通过34次进行固定。固定作用为杀死细菌，使蛋白质凝固，菌体牢固粘附于载玻片上，染色时不被染液或水冲掉，增加菌体对染料的结合力，使涂片易着色。4、 染色 在涂片处滴加草酸铵结晶紫染液12滴，使其布满涂菌部分，染色1分钟。斜置载玻片，倾去染液后用水轻轻冲去染液至流水变清。注意水流不得直接冲在涂菌处，以免将菌体冲掉。5、 媒染 滴加革氏碘液冲去残水，并用碘液覆盖1分钟，用水冲去碘液。6、 乙醇脱色 斜置载玻片于一烧杯上，滴加95%乙醇，轻轻摇动载玻片，至乙醇液不呈现紫色时停止（约0.5分钟）；立即用水冲净乙醇并用滤纸轻轻吸干。脱色是革
9、兰氏染色的关键，必须严格掌握乙醇的脱色程度。若脱色过度则阳性菌被误染为阴性菌；而脱色不够时阴性菌被误染为阳性菌。7、 复染 蕃红染液复染1分钟后水洗。8、 吸干并镜检用滤纸轻轻吸干载玻片上的水分，干燥后镜检。在研究工作中要确证未知菌的革兰氏反应时，则需要同时用已知菌进行染色作为对照。五、实验结果1、 描述所观察微生物的特征；2、 绘出所观察微生物的形态图；3、 记录革兰氏染色结果，分辨出革兰氏阳性菌或阴性菌；如果染色结果不理想，分析原因。六、讨论1、 为什么必须用培养24小时以内的菌体进行革兰氏染色？2、 要得到正取的革兰氏染色结果，必须注意那些操作？哪一步是关键步骤？为什么？3、 当你对未知菌进行革兰氏染色时，怎样保证操作正确，结果可靠？