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1、抗菌药物最小抑菌浓度的测定一、概念：最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC）：在特定环境下孵育24小时，可抑制某种微生物出现明显增长的最低药物浓度即最小抑菌浓度，用于定量测定体外抗菌活性。二、实验目的：通过采用常量稀释法, 检测几种抗菌药物对-菌株的最小抑菌浓度( MIC) , 对临床诊断用药有指导作用。三、仪器和试剂：MH液体培养基无菌试管分光光度计0.5麦氏标准比浊管MH琼脂微量加样器蒸馏水吸头0.1mol磷酸缓冲液（PH6.0）接种环无菌生理盐水无菌平板无菌滤膜0.22无菌针筒金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌抗菌药物四、检验方法：
2、液体稀释法、琼脂稀释法、E试验（E test）液体稀释法操作步骤：抗菌药物原液配置MH液体试管中抗菌药物梯度稀释待测菌和质控标准菌观察结果1.抗菌药物原液制备 抗菌药物贮存液浓度不应低于1000g/ml(如1280g/ml)或10倍于最高测定浓度。溶解度低的抗菌药物可稍低于上述浓度。所需抗菌药物溶液量或粉剂量可公式进行计算。例如：需配制100 ml浓度为1280g/ml的抗生素贮存液，所用抗生素为粉剂，其药物的有效力为750g/mg。用分析天平精确称取抗生素粉剂的量为182.6 mg。根据公式计算所需稀释剂用量为：（182.6 mg750g/ml）/1280g/ml=107.0ml，然后将18
3、2.6 mg抗生素粉剂溶解于107.0ml稀释剂中。制备抗菌药物贮存液所用的溶剂和稀释剂见表1。配制好的抗菌药物贮存液应贮存于-20环境，并注意抗菌药物的保存期限。表1 稀释法中常用的抗菌药物容积稀释法药物浓度 （ug/ml） 取药液量 （ml） 加稀释剂量 （ml） 药物稀释浓度 （ug/ml） 琼脂或肉汤中最后含药浓度（ug/ml） 药物：琼脂（或肉汤）=1：95120512051201280128012801601601602020202.52.52.51111111111111110131371371371375120256012806403201608040201052.51.250
4、.60.351225612864321684210.50.250.1250.060.032.药敏试验用抗菌药物浓度范围 根据NCCLS抗菌药物敏感性试验操作标准，药物浓度范围应包含耐药、中介和敏感分界点值，特殊情况例外。3.培养基 NCCLS推荐使用Mueller-Hinton（MH）肉汤，pH7.27.4。需氧菌及兼性厌氧菌在此培养基中生长良好。在测试葡萄球菌对苯唑西林的敏感性时，应在肉汤中加入2%（W/V）氯化钠，按制造厂家的要求配制需要量的MH肉汤。嗜血杆菌属菌使用HTM肉汤，肺炎链球菌和其它链球菌使用含2%5%溶解马血的MH肉汤。4.接种物的制备 有2种方法配制接种物，一是细菌生长方法
5、，用接种环挑取形态相似待检菌落3-5个，接种于4-5ml的水解酪蛋白（MH）肉汤中，35孵育2-6h。增菌后的对数生长期菌液用生理盐水或MH肉汤校正浓度至0.5麦氏比浊标准，约含12108CFU/ml。二是直接菌落悬液配制法，对某些苛养菌，如流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌和链球菌及甲氧西林耐药的葡萄球菌等菌株，推荐直接取培养1824h的菌落调配成0.5麦氏比浊标准的菌悬液。用MH肉汤将上述菌悬液进行1100稀释后备用。注意应在15分钟内接种完配制好的接种物，并取一份接种物在非选择性琼脂平板上传代培养，以检查接种物纯度。5.稀释抗菌药物的制备及菌液接种 取无菌试管（13100mm）13支，排成一排，除
6、第1管加入1.6mlMH肉汤外，其余每管加入MH肉汤1ml，在第1管加入抗菌药物原液（如1280g/ml） 0.4ml混匀，然后吸取1ml至第2管，混匀后再吸取1ml至第3管，如此连续倍比稀释至第11管，并从第11管中吸取1ml弃去，第12管为不含药物的生长对照。此时各管药物浓度依次为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25g/ml。然后在每管内加入上述制备好的接种物各1ml，使每管最终菌液浓度约为5105CFU/ml。第1管至第11管药物浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、05、0.25、0.125g/ml。另外设对照3支，别为肉汤对照、质控菌对照和
7、待测菌生长对照。6.孵育 将接种好的稀释管塞好塞子，置35普通空气孵箱中孵育1620h；嗜血杆菌和链球菌在普通空气孵箱中孵育2024h；对可能的耐甲氧西林葡萄球菌和耐万古霉素肠球菌应持续孵育满24h。7.结果判断与解释 在读取和报告所测试菌株的MIC前，应检查生长对照管的细菌生长情况是否良好，同时还应检查接种物的传代培养情况以确定其是否污染，质控菌株的MIC值是否处于质控范围。以肉眼观察，药物最低浓度管无细菌生长者，即为受试菌的MIC。甲氧苄胺嘧啶或磺胺药物的肉汤稀释法终点判断，与阳性生长对照管比较抑制80%细菌生长管药物浓度为受试菌MIC。【MIC参考范围】表2稀释法质控标准菌株MIC预期值
8、范围（ug/ml）抗菌药物 金黄色葡萄球菌 （ATCC29213） 粪肠球菌 （ATCC29212） 大肠埃希菌 （ATCC25922） 铜绿假单胞菌 （ATCC27853） 青霉素G苯唑西林 甲氧西林 氨苄西林 哌拉西林 头孢噻吩 头孢唑啉 头孢呋辛 头孢他啶 头孢唑肟 氨曲南 庆大霉素 阿米卡星 克林霉素 红霉素 万古霉素 环丙沙星 0.251.00.120.50.52.0-0.120.50.251.0-0.121.0-0.060.250.120.50.52.00.120.51.04.0-0.52.0-1.04.01.04.00.252.0-2.08.01.04.04.0161.04.02
9、.08.00.060.50.030.120.060.250.251.00.54.0-0.0040.015-1.04.0-1.04.016642.08.01.04.02.08.0-0.251.0常用抗菌药物稀释和配制方法药物溶媒配制方法青霉素N.S一次氨苄西林N.S一次氨苄西林氟氯西林N.S一次氨苄西林舒巴坦N.S一次阿莫西林氟氯西林N.S一次阿莫西林舒巴坦N.S一次阿莫西林克拉维酸N.S一次奈夫西林N.S一次阿洛西林5%GNS，5-10%G.S二次，每g先用10ml注射用水溶解美洛西林5%GNS，5-10%G.S一次美洛西林舒巴坦N.S,5%GNS,5-10%G.S二次，先用适量注射用水或生理
10、盐水溶解羧苄西林5%G.S一次替卡西林克拉维酸5%G.S二次，先用10ml注射用水溶解哌拉西林无一次哌拉西林他唑巴坦5%G.S，NS一次哌拉西林舒巴坦5%G.S，NS一次苯唑西林N.S，G.S一次头孢唑啉N.S，G.S二次，先用注射用水溶解五水头孢唑啉N.S，5%G.S二次，先用注射用水溶解头孢硫脒N.S一次头孢噻吩N.S，5%G.S二次先4g用20ml注射用水溶解头孢呋辛无一次头孢美唑N.S，G.S一次头孢替安N.S，G.S一次头孢替唑N.S，G.S一次头孢尼西N.S，5-10%G.S一次头孢西丁N.S，5-10%G.S一次头孢孟多N.S，5%G.S一次头孢他定N.S，5%G.S一次头孢曲松
11、N.S，5%G.S二次，先用注射用水、N.S、G.S配成0.1g/ml头孢哌酮G.N.S一次，终浓度为5-25mg/ml头孢哌酮舒巴坦N.S，5%G.S二次，1g水溶后总量4ml，再用同一溶媒溶解。头孢哌酮他唑巴坦N.S，5%G.S二次先用注射用水、N.S 5-10ml溶解拉氧头孢N.S，5%G.S一次头孢米诺N.S，5-10%G.S一次头孢唑肟N.S，10%G.S一次头孢地嗪N.S，林格，5%G.S一次头孢甲肟N.S，G.S一次头孢匹胺N.S，G.S一次头孢吡肟N.S，G.S一次头孢匹罗N.S，G.S一次亚胺培南西司他汀N.S，G.S一次美罗培南N.S，5-10%G.S二次，可先用合适液体配
12、制氨曲南N.S，5-10%G.S二次，1g先用至少3ml注射用水溶解，终浓度不超过2%阿奇霉素N.S，5%G.S二次先用注射用水稀释成0.1mg/ml，再稀释成终浓度为1-2mg/ml依替米星N.S，5%G.S一次多西环素N.S，5%G.S二次先用注射用水或其他溶液稀释成10mg/ml，再溶解成0.1-1mg/ml克林霉素无一次万古霉素N.S，5%G.S二次先用10ml注射用水溶解，再加入至少200ml溶液中。滴注1小时。去甲万古霉素N.S，5%G.S二次先用注射用水溶解，再用至少200ml液体慢滴。替考拉宁N.S，5%G.S二次先用注射用水溶解，双手滚动小瓶至药粉全部溶解。如果出现泡沫，静置
13、15分钟。培氟沙星5%G.S一次氟罗沙星5%G.S一次洛美沙星N.S，5%G.S二次，先用5ml注射用水溶解左氧氟沙星N.S， G.S一次加替沙星N.S，5%G.S一次，终浓度为2mg/ml依诺沙星5%G.S一次帕珠沙星N.S一次利福霉素5%G.S一次氟康唑无一次两性霉素B5%G.S（用NS有沉淀）二次5ml注射用水溶解25mg药物，终浓度0.1mg/ml，避光慢滴6h以上阿昔洛韦N.S，5%G.S二次每0.1g用10ml注射用水溶解成50g/l。再用大瓶稀释成至少100ml。终浓度不超过7g/l。慢滴。注意水化更昔洛韦N.S，5%G.S先用N.S或注射用水溶解，再用大瓶稀释成100ml。浓度
14、不超过10mg/ml，一次最大量6mg/kg聚安洛韦N.S，5%G.S一次膦甲酸钠无一次注意水化（2.5L/d），可适当用利尿剂，慢滴阿糖腺苷无一次日剂量10mg/kg病毒唑N.S，5%G.S一次1mg/ml，慢滴磷霉素N.S，5%G.S先用注射用水溶解。慢滴1-2小时。总结：1. N.S溶解：青霉素、氨苄西林类、阿莫西林类、奈夫西林、头孢硫脒、帕珠沙星（阿青安怕牛来） 2. G.S溶解：培氟沙星、氟罗沙星、曲伐沙星、依诺沙星、两性霉素B/利福霉素（两粒） 3. 需二次配制的：青霉素类：阿洛西林、美洛西林舒巴坦、替卡西林克拉维酸（阿美卡拉）；头孢类：唑啉、噻吩、曲松、哌酮舒巴坦（他唑巴坦）；两粒霉素B、磷霉素、多西环素、阿奇霉素、洛美沙星（20多哈罗）、万古霉素、去甲万古霉素、替考拉宁；阿昔洛韦、更昔洛韦、氨曲南、美罗培南