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1、生物技术知识点整理【2017年联赛】22. 测序 逆转录PCR：以mRNA为模板，利用逆转录酶反转录成cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增，获得目的基因或检测基因表达。缺陷：检测基因数目有限。 基因芯片技术：二维DNA探针阵列，用于基因检测工作。可同时快速准确地分析数以千计的基因组信息。 第二代测序技术（基本原理：边合成边测序）：Sanger等测序方法（Sanger法是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得可见DNA碱基序列的一种方法
2、。在分子生物学研究中，DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。是目前用于DNA测序的主要技术。） 第三代测序技术（单分子测序技术）：高通量测序，应用于基因表达的检测。23. 分离纯化蛋白 凝胶过滤层析法：利用具有多孔网状结构的颗粒的分子筛作用，根据被分离样品中各组分相对分子质量大小的差异进行洗脱分离的一项技术。又称为排阻层析或分子筛方法，主要是根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质的质量进行分离和纯化。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖（如葡聚糖或琼脂糖）类物质，使蛋白质混合物中的物质按分子大小的不同进行分离。也叫做分子排阻层析。一种利用带孔凝胶珠作基质，按照分子大
3、小分离蛋白质或其它分子混合物的层析技术。 一般是大分子先流出来，小分子后流出来。 亲和层析：利用生物大分子与某些相对应的专一分子特异识别和可逆结合的特性而建立起来的一种分离生物大分子的层析方法。只需一步处理即可得到纯度较高的某种蛋白质。它是根据不同蛋白质对特定配体的特异而非共价结合的能力不同进行蛋白质分离的，将具有特殊结构的亲和分子制成固相 吸附剂放置在层析柱中，当要被分离的蛋白混合液通过层析柱时，与吸附剂具有亲和能力的蛋白质就会被吸附而滞留在层析柱中。那些没有亲和力的蛋白质由于不被吸附，直接流出，从而与被分离的蛋白质分开，然后选用适当的洗脱液 ，改变结合条件将被结合的蛋白质洗脱下来，这种分离
4、纯化蛋白质的方法称为亲和层析。 补充：固相是指由固体组成的相。相，是物理学名词。成份、结构相同的组织统称为相。与液相反应一样，固相反应的发生起始于两个反应物分子的扩散接触，接着发生化学作用，生成产物分子。固相化学研究固体物质的制备、结构、性质及应用。 洗脱液是一种交换树脂后所得到的溶液，产生方式为再生液流过已饱和的离子。洗脱液的选择：洗脱液可选择水、甲醇、乙醇、丙酮、不同浓度的酸碱液等。根据吸附作用的强弱可选择不同的洗脱液或不同浓度的同一溶剂对各类成分进行粗分。其一般方法如下：用适量水洗，洗下单糖、鞣质、低聚糖、多糖等极性物质，用薄层色谱检识，防止极性大的皂苷被洗下；7O%乙醇洗，洗脱液中主要
5、为皂苷，但也含有酚性物质、糖类及少量黄酮，实验证明30%乙醇不会洗下大量的黄酮类化合物；3%5%碱溶液洗，可洗下黄酮、有机酸、酚性物质和氨基酸；10%酸溶液洗，可洗下生物碱、氨基酸；丙酮洗，可洗下中性亲脂性成分。 离子交换层析:离子交换层析中，基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有正电荷的称之阴离子交换树脂；而带有负电荷的称之阳离子树脂。离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化。由于蛋白质也有等电点，当蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋
6、白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。 纸层析法：依据极性相似相溶原理，是以滤纸纤维的结合水为固定相，而以有机溶剂作为流动相。由于样品中各物质分配系数不同，因而扩散速度不同，从而达到分离的目的。 总结：亲和层析、离子交换层析和纸层析均能分离纯化蛋白，不能测定其分子量。凝胶过滤层析均可。24.测定蛋白质及其各亚基分子量 凝胶过滤层析：测定蛋白质的分子量，未破坏蛋白质结构，可以测整个寡聚蛋白质的分子量。 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（与凝胶过滤层析同理）：或称为活性电泳是在不加入SDS 和疏基乙醇等变性剂
7、的条件下，对保持活性的蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，用于酶的鉴定、同工酶分析和提纯。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：十二烷基硫酸钠（SDS）作为阴离子表面活性剂，使蛋白质变性解离成单一亚基，可用以测定寡聚蛋白质的各个亚基的分子量。 核磁共振：研究蛋白质三维结构。 等电聚焦电泳：利用蛋白质两性解离及等电点的特征，测定蛋白质等电点。【2018年联赛】2. Southern印迹杂交：进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。其基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则特异性地杂交形成双链。一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位
8、将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量。 Northern杂交：利用DNA可以与RNA进行分子杂交来检测特异性RNA的技术，首先将RNA混合物按它们的大小和分子量通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，分离出来的RNA转至尼龙膜或硝酸纤维素膜上，再与放射性标记的探针杂交，通过杂交结果可以对表达量进行定性或定量。RNA混合物进行琼脂糖凝胶电泳分离得到的RNA转膜与放射性标记的探针杂交 结果分析。 蛋白质印迹法（免疫印迹试验Western Blot）：它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学
9、中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。用于蛋白质的定量和定性。 实时荧光定量PCR技术（Real time PCR）：是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。通过逆转录过程得到的cDNA模板量与原mRNA的丰度相关，确定cDNA含量也就确定了对应mRNA丰度。4. 观察蛋白质在细胞内定位的方法 荧光显微镜 免疫荧光技术（使用荧光标记的抗体） 将EGFP(GFP)蛋白基因连接到目标
10、蛋白的基因上 电镜 免疫胶体金：在抗体上添加胶体金粒，吸附在目标蛋白上，电镜下电子难以穿透金粒，故显示黑色。14-20题组： 免疫共沉淀：研究蛋白质相互作用。在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质间的相互作用的复合体被保留了下来。23.蛋白质分离纯化 超滤：可理解为加压后的渗透。对半透膜内的溶液加压，小分子能透过半透膜，在压力作用下渗出；大分子蛋白不能透过半透膜而被富集。常用于蛋白质除盐。24.分离纯化中引起蛋白质变性的因素 低温有机溶剂法：分离纯化蛋白质，通常不变性。31.用来研究生物的基因表达情况的高通量实验技术 基因表达情况检测方法：检测RNA或Pr。 全基因组重测序：全基因组重测序是对已知基因组序列的物种进行不同个体的基因组测序，并在此基础上对个体或群体进行差异性分析。 转录组：广义上指某一生理条件下，细胞内所有转录产物的集合，包括信使RNA、核糖体RNA、转运RNA及非编码RNA；狭义上指所有mRNA的集合。 外显子组测序：外显子测序是指利用序列捕获技术将全基因组外显子区域DNA捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法，可以进行差异性分析。可用来确定孟德尔遗传病。