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1、1,第六章 食品中药物残留的检测,2,第一节 药物残留概述,一、药物残留的概念及分类 现代化的畜禽生产中，普遍使用抗生素类药物。在农业生产上，抗生素可以防治病虫害，刺激植物生长，提高产量。造成了抗生素在食品中的残留。,3,为了达到投入少量的饲料而获得更多畜产品的目的，往往使用激素来促进畜禽的生长发育。常用于食品动物的激素为性激素具有促进生长发育、增加体重和同步发情等作用，广泛用于畜牧业生产中，通过饲料添加剂或皮下置入等方法而摄入牲畜体内，造成了肉食品中激素残留而影响人体健康。 食用含有药物残留的食品，使人类的健康受到了极大的危害，引起了世界各国的关注。因此，对食品中药物残留情况，必须加以监测，
2、以保证食用安全。,4,药物使用后，部分药物被分解或直接排出体外，另一部分将残留在畜禽体内，这种残留称为药物残留(residue of drugs， residue of veterinary drugs)。,5,主要残留药物有以下几类：,1抗生素类：包括青霉素、链霉素、金霉素、土霉素、四环素、泰乐菌素等。 2呋喃药类：包括呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃呾啶等。 3磺胺药类； 4. 抗球虫药； 5. 激素药类； 6. 驱虫药类。,6,二、药物对食品的污染及危害,(一)药物对食品的污染 1预防和治疗畜禽疾病 2作为饲料添加剂使用 3保鲜：在食品的保鲜过程中，有时加入某种抗生素以抑制微生物的生长、繁殖，使
3、用后也会对食品造成污染。,7,（二）药物的残留对人体的危害,药物虽然有预防和治疗疾病的作用，但同时对机体也产生有害的作用。药物与毒物之间并无明显的界限，有些毒物在适当的剂量时具有治疗作用，而所有药物过量或应用时间过长，均有毒性。残留的药物对人体的不良影响主要有： 1毒性作用 2使某些细菌产生抗药性 3过敏反应 4造成菌群失调 5致癌作用：现已证明残留在食品中的克球粉、雌激素具有致癌作用。,8,三、各种药物的使用原则,（一）合理配伍用药 畜禽发生疾病以后要正确诊断，合理用药，能用一种药的情况下不用多种药。 （二）按国家规定的范围、剂量使用药物 各国政府都严格规定了各种药物的使用条件。多数国家规定
4、对生命期短的食用动物禁止应用雌激素。,9,（三）使用兽用专用药物 一些国家规定，凡是人类经常使用的抗生素及其药物不能作为畜禽饲料添加剂。世界卫生组织不主张用链霉素饲喂动物，以免产生耐药性菌株。 （四）要有一定的休药期 所谓的休药期是指食品动物从停止给药到许可屠宰或它们的产品许可上市的间隔时间。 此时间的规定是根据上述物质在动物体内代谢的消除率和残留量不致影响人体健康为依据的。,10,第二节 食品中抗生素的测定,抗生素种类繁多，结构复杂，测定方法各不相同。因而给检测工作带来了许多困难。抗生素的测定方法进展很快。主要可分为微生物测定法，化学测定法和物理测定法三大类。,11,其中以微生物测定法应用较
5、广。因其测定原理基于抗生素对微生物的生理机能和代谢作用的抑制，所用试剂数量少，仪器简单。如牛乳中TTC测定法，肉中四环素杯蝶测定法都属于微生物分析法，但这类方法测定时间较长，且结果误差较大。,12,化学测定法和物理测定法则利用抗生素中某些基团的特殊性质或反应来测定其含量的分析方法。包括比色法、荧光分光光度法、气相色谱法和高效液相色谱法。,13,一、高效液相色谱 HPLC,（一）高效液相色谱法的特点 1分离效能高 2选择性高 3检测灵敏度高 4分析速度快 对于高沸点、热稳定性差、相对分子质量大的有机物原则上都可用HPLC进行分离、分析。目前已广泛应用于化工、食品、医药、生化、卫生、环境保护和高能
6、化合物等生产和科研工作中。,14,二、四环素类抗生素残留量的测定,食品中四环素类抗生素的测定多采用微生物法。 （一）原理 样品经提取，用离子交换树脂分离，甲醇溶剂洗脱，经浓缩，残渣用Mcllvaine缓冲液溶解，经荧光鉴定，然后用微生物法进行定量测定。本方法的最低检出量为0.05mg/kg。,15,（二）其它抗生素也可用此法进行测定，只是试验的菌种不同或培养基不同。测定青霉素为金黄色葡萄球菌，链霉素或双氢链霉素为枯草杆菌（6633），氯霉素为卵黄色八叠球菌（9341），新生霉素为白色葡萄球菌。,16,三、链霉素残留量的测定（比色分析法）,（一）原理 在酸性条件下，链霉素可与二硝基苯肼反应生成黄
7、色的链霉素二硝基苯腙；多余的试剂经乙酸丁酯提取除去后，于430nm波长处测吸光度，以标准曲线求出样品中链霉素的含量。,17,四、鲜乳中抗生素残留量的测定（TTC试验）,（一）原理 当乳中含有抗生素时，标准菌株嗜热链球菌的生长受到抑制，不能将指示剂2,3,5氯化三苯基四氮唑（TTC）还原为无色。反之，当乳中抗生素不存在时，加入的标准菌株，就会大量生长繁殖，而且将TTC还原为红色化合物。其红色强度与细菌数量成正比。 本法对各种抗生素的最低检出量：青霉素为0.004IU/mL，链霉素为0.5IU/mL，庆大霉素为0.4IU/mL,18,（二）注意事项 1.本法的正确性与菌种的活力有密切关系。如菌种活
8、力减弱时，应多次反复传代加强活力。 2.每次检验每个样品应一式二份，另外要作阴性、阳性对照各2管，阴性对照管作无抗生素乳9mL，阳性对照管用无抗生素乳9mL加抗生素。 3.水浴培养要避光，保持37，水面高于被检样品，判断要迅速；检样经80水浴加热5min，要严格掌握。 4.制备培养基的乳要绝对无抗生素存在；操作所用试管、吸管均须经灭菌。,19,第三节 食品中激素的测定,由于动物性食品中性激素的含量极微，所以一般的测定方法受到了限制，较常用的方法有薄层色谱法、荧光分析法、气相色谱法和高效液相色谱法等。其中高效液相色谱法具有更大的优越性，并有取代其它方法之势。 一、性激素总量的测定（薄层色谱法）
9、（一）原理 样品中的性激素经有机溶剂提取、浓缩，在硅胶G薄层板上点样、展开后，以硫酸显色，与标准斑点进行比较，从而达到定性和半定量的目的。,20,硅胶H 硅胶中未加入粘合剂 硅胶G 硅胶中加入粘合剂石膏 硅胶S 硅胶中加入粘合剂淀粉 硅胶HF254 硅胶H中加入波长254nm荧光物质 硅胶GF254 硅胶G中加入波长254nm荧光物质,常见的几种硅胶吸附剂,21,（二）注意事项 1.薄层色谱法可用于性激素的鉴别、半定量测定以及含量测定前的分离。 2.由于性激素的种类多，故所用的溶剂系统、吸附剂、展开剂和显色剂不能一概而论。可根据具体情况，挑选效果最佳者使用。,22,二、雌激素残留量的测定（包括
10、己烯雌酚的测定）（荧光分光光度法),（一）荧光分光光度法 1. 原理 样品中雌激素经盐酸水解为甾体缀合物，用有机溶剂提取后，再经硫酸处理，在紫外光照射下，产生蓝色荧光；其激发波长542nm，发射波长560nm，根据荧光强度，可测定雌激素的含量。,23,2. 注意事项 (1)本法测定的是雌激素的总量，包括雌酮、雌二醇和雌三醇。 (2)操作过程中加入氢醌，可防止荧光产物氧化，增进荧光的稳定性；二氯甲烷溶剂中加入对硝基苯酚也起增进荧光稳定性的作用。 (3)因为雌激素有酚羟基存在而呈弱酸性，用碳酸氢钠缓冲液（pH 10.5）洗涤，可将那些强酸性物质洗掉。,24,(4)测定中用NaOH振摇，可使雌激素转
11、入NaOH 液层，而中性甾体仍留在有机相中，起到清除杂质的作用。 (5)在作乙醚提取之前，加入固体碳酸氢钠调节pH至10，是乙醚定量提出雌激素的关键。,25,(二）液相色谱法,1.原理 试样匀浆后，以甲醇提取过滤，注入HPLC柱中，以紫外检测器鉴定。于波长230nm处测定吸光度，同条件下绘制工作曲线，己烯雌酚含量与吸光度值在一定浓度范围内成正比，试样与工作曲线比较定量。本法适用于新鲜鸡肉、牛肉、猪肉、羊肉中己烯雌酚残留量的测定。,26,2.分析步骤 （1）提取及净化：甲醇 （2）色谱条件 （3）绘制标准曲线 （4）测定,27,3. 注意事项 （1）对主要影响因素甲醇、磷酸二氢钠、pH采用正交试验选择最佳实验条件。 （2）本法采用两次提取（甲醇），离心、过滤，回收率高，但灵敏度不太高。 （3）使用流动相时，预先进行超声波脱气，以防气泡堵塞色谱柱。,28,本章思考题,1. 名词解释：药物残留，休药期。 2. 药物残留对人体有哪些危害？ 3. 测定己烯雌酚时怎样防止荧光产物氧化？测定过程中加入氢氧化钠有什么作用？ 4.液相色谱法测定雌激素的原理是什么？,