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1、AMAMFSAc18075 黄油 （残留的）磷酸酶 分光光度法AM-AM-FS-Ac-18075黄油中(残留的)磷酸酶1.试验过程 参见18-32C在检测和测量牛奶的磷酸酶活性中所涉及的化学原理对于所有的乳制品都是同样的，但不同的乳制品需要改进方法，因为它们的物理性质、结构和尤其是缓冲容量不同。对牛奶和其它流质制品，过程如下:步骤1分取1.0ml样品放入2个或3个试管中(1个试管作为对照或空白，最好有两个以上试管进行平行测定)(山羊奶用3ml样品)。步骤2在沸水的带盖的烧杯中加热空白约1min(整个试管温度必须在8595)，冷却到室温。逐个同样处理空白和试样。步骤3加10.0mlBa缓冲基质
2、(b)(1)或 (2)，塞紧试管，混合 (pH10.00.15)。(这个基质对鲜奶，甜脱脂酸奶或干酪乳浆是很满意的。对于长时间或轻微发酸的牛奶，使用由未稀释的缓冲溶液(a)(1)制备的基质;对于巧克力饮料，用由1/4体积水稀释的缓冲液制备的基质;对于很酸(pH4.5)的脱脂酸奶，由2611缓冲液18-128A(a)(2)制备基质;而对于山羊奶，由2711缓冲液A(a)(2)制备基质。对未知样品的定量结果，调节pH到l0.010.05。步骤4加入基质后，立即在3738水浴上培养1h，不时地混合或摇动。步骤5在沸水烧杯中加热约1min(试管中物质的温度应达到8590，在另一个同样大小和形状含有同样
3、体积液体的试管中用温度计测定)。在冷水容器中冷却到室温。步骤6对于鲜奶，甜脱脂酸奶或干酪乳浆飞移取1.0mlZn丁Cu蛋白质沉淀剂(C)。(对于长时间的或轻微发酸的牛奶或酸化脱脂酸奶，以1.0m16.0%的ZnSO47H2O溶液代替;对巧克力饮料，甩1.0ml含4.5gZnSO47H2O和0.1gCuSO45H2O/100ml溶液;而对山羊奶，用1.0m1含7.5gZnSO47H2O和0.1gCuSO45H2O/100ml的溶液)充分混合 (混合物的pH应为9.09.1)。步骤7过滤(5cm漏斗，9cmWhatman42号或2号滤纸，或相当的)并把5.0ml滤液收集在试管中，最好用刻度在5.0
4、和10.0ml的试管。步骤8加5.0ml发色缓冲液 (a)(2)(混合物的pH应为9.39.4)。步骤9加4滴BQC溶液(d)混合，在室温发色30min(对只检验不足的巴氏灭菌，仅加2滴BQC溶液)。步骤10用下列方法之一测定蓝色的强度:(a)用光度计读空白和试液的颜色强度(使用具有最大T的大约6610nm的滤光片)，从试样读数中减去空白的读数，参考标准曲线 (9)(2)，把结果转化为酚当量。使用光度计时，一般不必用BuOH萃取;如果按(b)中进行BuOH萃取，离心5min破坏乳胶体并除去悬浮在乙醇层中的水。(Babcock离心瓶对这个目的是适用的用如下制作专用的试管架:从适当直径的橡胶塞上切
5、下6mm厚，装迸离心杯的底部，把2个适当直径的软木塞粘在一起，通过中心打一个适当大小的洞，以便固定试管，把一对软木塞插入杯中。)离心后，用顶部带橡皮球的移液管，除去几乎全部BuOH。渗入光度计池中，用具有最大T约650nm滤光片读数。(b)用目视标准对于产生大于5个颜色单位的样品，将试管中的颜色与酚标准水溶液 (g)(2)的颜色比较。对于边界情况的定量结果 (即试样产生0.55颜色单位)，用BuOH(f)萃取。加5.0mlBuOH并慢慢颠倒试管几次;如果必须提高乙醇层的清晰度，可按 (a)中离心，与经同样处理的酚标准液 (g)(2)的颜色比较。步骤11发色中，观察到强烈的阳性试验中(即20单位
6、)，用4滴BQC可能不足以与所有酚结合，移取适量部分到另一管中用稀发色缓冲液(a)(3)稀释到10.0ml，再加2滴的BQC溶液。对于每个试验都稀释而且同样处理空白。如果稀样品试验仍是很强的阳性，再用同样方法稀释直到最终颜色在目视标样或光度标样曲线范围之内。在最后一次加入BQC后，进行最后读数前，使其发色30min。为校正稀溶液的读数，对于5+5稀溶液乘以2，对于1+9稀溶液乘以10，对于2+8稀释后又1+9稀释溶液乘以50，等等。步骤12用1.0ml样品加11.0ml试剂(总液体12.0ml，用5.0ml滤液)时:用读数值乘以1.2转变为酚当量/0.5ml样品。(如果愿意也可以乘2.4将结果
7、变为酚当量/1ml样品)在鲜奶、巧克力饮料、脱脂酸奶和奶酪乳浆中，酚当量大于2/0.5ml表明消毒不够，山羊奶中酚量大于1/1.5ml表明消毒不足。注意:为试验浓缩的奶制品，用H2O重新制成原有牛奶固体含量的制品，并且用原产品规定方法进行试验。，用干净的小刀或刮刀，从紧靠表面下面取样，并如下列步骤进行测定: 步骤1在约2.5cm见方的蜡纸片上称1.0g样品(最好是双份)，并把有样品的纸放入管中。同样称另一样品放大管中作为对照或空白。 步骤2在沸水烧杯中，加热空白约1min，到8590(以便盖上整个管子，加热到8590)，冷却到室温。同样处理空白和试样。 步骤3加10.0ml按18-32A(b)
8、制备的缓冲基质，只是把Na2C6H6PO4溶于100ml未稀释的，18gBa(OH)28H2O和8gH3BO3/L制成的硼酸氢氧化钡缓冲液中。塞住管子混合。 步骤4加入基质后，立即在3738水浴中培养1h，混合或不时摇动; 步骤5在沸水烧杯中加热近1min到8590(在另一个同样大小和形状，装有同样体积液体的管中，使用温度计测量)，在冷水容器中冷却到室温。 步骤6移入1ml 6.0%ZnSO47H2O溶液，充分混合 (混合物pH应为9.09.1)。 步骤7过滤(5cm漏斗，建议使用9cm Whatman42号或2号滤纸)，最好在5.0和10.0ml刻度管中收集5.0ml滤液。 步骤811按18-43C称100g样品放入250ml容量瓶，加100ml H2O和2ml H2SO4(1+1)混合，避免剧烈摇动。加15ml 10%Na2WO42H2O溶液，稀释到刻度，混匀，用快速滤纸过滤。把150ml滤液转到蒸馏瓶中进行蒸馏，色谱分离。进行。 步骤12用1.0g黄油加11.0ml液体时，用1.1乘以读数值，将结果转变成酚当量/0.5g黄油 (数值大于2当量/0.5g，表示巴氏灭菌不足)。2.来源AOAC 官方方法946.02（第17版）