DNA的粗提取与鉴定(修改版).ppt

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1、DNA的粗提取与鉴定,目的要求 知道DNA提取原理 据原理设计DNA提取方法 能对DNA进行鉴定 掌握本实验的基本操作方法,一、实验原理,1.血细胞在蒸馏水中会渗透吸水过度而导致细胞膜和细胞核膜的破裂。利用此特性可得到含有DNA的溶液。,2.DNA在氯化钠溶液中的溶解度,是随着氯化钠的浓度的变化而改变的。DNA在物质的量浓度为0.14 molL的氯化钠溶液中的溶解度最低,利用这一原理,可以使溶解在氯化钠溶液中的DNA析出。,3.DNA不溶于酒精溶液,但细胞中的某些物质则可以溶于酒精。利用这一原理,可以进一步提取出含杂质较少的DNA。,4.DNA遇二苯胺(沸水浴)会变成蓝色,因此,二苯胺可以作为

2、鉴定DNA的试剂。,5.注意事项:最好使用塑料的烧杯和试管盛放鸡血细胞液,实验材料和用具,实验材料: 1、新鲜鸡血细胞液(510ml); 2、体积分数为95%的冷酒精溶液(实验前置于冰箱内冷却24h); 3、蒸馏水; 4、质量浓度为0g/ml的柠檬酸钠溶液(抗凝剂) ; 5、物质的量浓度分别为2mol/L和0015mol/L的NaCl溶液; 6、二苯胺试剂。,实验用具: 铁架台;铁环;镊子;三角架;酒精灯;石棉网;载玻片;玻璃棒;滤纸;滴管;量筒(100ml,一个);烧杯;(100ml,一个,50ml、500ml各二个);试管(20ml,二个);漏斗;试管夹;纱布。,二、方法与过程,1.制鸡血

3、细胞液(活鸡鲜血经分离或沉淀获得),500mL烧杯中,玻棒搅拌,离心、分离或静置沉淀。,2.提取DNA。,取血细胞5-10mL20mL蒸馏水,用玻棒沿一个方向快速搅拌。,两层纱布过滤:滤液中含DNA和其他核物质,如蛋白质。,原理:血细胞的细胞膜、核膜吸水涨破,玻璃棒快速搅拌,机械加速血细胞破裂。,.提取血细胞核物质:,.溶解核内的DNA:,滤液2mol/L的NaCl溶液40mL,玻棒沿一个方向轻缓搅拌。,不要碰底!,用吸管吸走上清液,抗凝剂,DNA含量高,防止DNA破碎,防止DNA破碎,溶解DNA效果好,取滤液,涨破,.析出含DNA的粘稠物:,.滤取含DNA的粘稠物:,. DNA粘稠物的再溶解

4、:,在上述溶液中缓缓加入蒸馏水,并沿一个方向轻轻搅拌,出现白色丝状物;当丝状物不再增加时,停止加水(此时NaCl溶液的浓度相当于0.14mol/L)。,用多层纱布过滤,含DNA的粘稠物留在纱布上。,在20mL烧杯中一个方向轻缓搅拌3min,使尽可能多的DNA溶解在NaCl溶液。,.过滤含有DNA的NaCl溶液:,用放有两层纱布的漏斗过滤步骤所得的溶液,滤液中含有DNA。,取滤渣(析出物),取滤液,含杂质的DNA,.提取含有杂质较少的DNA:,步骤所得的滤液体积分数为95%的冷却酒精50mL,用玻棒沿一个方向轻缓搅拌,溶液中析出乳白色丝状物,用玻棒将丝状物卷起,并用滤纸吸取上面的水分。,3.DN

5、A的鉴定:,加入0.015mol/L的NaCl溶液5mL和二苯胺试剂4mL,用玻棒搅拌使DNA溶解,沸水浴5min,待冷却后观察溶液是否出现蓝色。,1.共有“三次过滤,两次析出,七次搅拌”,2.加入“两次蒸馏水,三次NaCl溶液,一次酒精”,三、实验小结,析出DNA效果好,DNA细小易碎,反应条件,溶解DNA,防止血凝固,使血细胞涨破,溶解DNA,使2mol/L的NaCl溶液稀释至0.14mol/L使得 DNA最大限度地析出,使含DNA的黏稠物被留在纱布上,使含DNA的黏稠物尽可能多的溶解于溶液中,除去含DNA的滤液中的杂质,析出DNA, A出现蓝色 B无变化,2.实验中NaCl的物质的量浓度

6、为2 molL和0.14 molL对DNA有何影响?,1.在DNA的粗提取实验过程中,两次向烧杯中加入蒸馏水的作用是( )。 A.稀释血液、冲洗样品 B.使血细胞破裂、降低NaCl浓度使DNA析出 C.使血细胞破裂、增大DNA溶解量 D.使血细胞破裂、提取含杂质较少的DNA,答:B,答:前者是溶解DNA,后者是使DNA析出,反馈练习,3.DNA遇二苯胺(沸水浴)会染成( ) A.砖红色 B.橘黄色 C.紫色 D.蓝色,4.提取鸡血中的DNA时,为什么要除去血液 中的上清液?,答:DNA的提取,关键是对杂质的去除,由于上清液是血液中的血浆部分,不含DNA,所以要除去上清液(含有蛋白质)。,答:D

7、,1、在制备鸡血细胞液的过程中,加入柠檬酸钠的目的是( ) A .防止凝血 B. 加快DNA析出 C .加快DNA溶解 D.加速凝血,练一练,A,2、DNA的溶解度最低时,NaCl的物质的量浓度为( ) A 2mol/l B 0.1mol/l C 0.14mol/l D 0.015mol/l 3、在向溶解DNA的NaCl溶液中,不断加入蒸馏水的目的是( ) A 加快DNA溶解的速度 B 加快溶解杂质的速度 C 减小DNA的溶解度,加快DNA析出 D减小杂质的溶解度,加快杂质的析出,C,C,4、向溶有DNA的2mol/L的NaCl溶液中不断加入蒸馏水,在这个过程中DNA的溶解度变化情况分别是 A

8、 减小;减小 B 增大;增大 C 先减小后增大 D增大; 减小 5、欲使溶有DNA的2mol/L的NaCl溶液中的DNA析出,最有效的办法是 A 加蒸馏水 B 加矿泉水 C 加清水 D 加生理盐水,6、与析出DNA粘稠物有关的叙述,不正确的是 A 操作时缓慢滴加蒸馏水,降低DNA的溶解度 B 操作时用玻棒轻缓搅拌以保证DNA分子的完整 C 加蒸馏水可以同时降低DNA和蛋白质的溶解度 D 当丝状粘稠物不再增加时,NaCl溶液的浓度可以认为是0.14mol/L,7、你能采用其他方法对DNA进行鉴定吗?,用甲基绿染液。结果丝状呈现绿色。,8、DNA遇二苯胺会染成(沸水浴) A 硅红色 B 红色 C

9、紫色 D 蓝色,D,四、实验原理拓展介绍。,1.DNA的释放。,DNA主要在鸡血细胞的细胞核内,正常情况下不会释放出来,蒸馏水对于鸡血细胞是一种低渗液,水分可以大量进入血细胞,使之涨破,同时加上玻璃棒快速搅拌的机械作用,加速血细胞的细胞膜和核膜的破裂。但释放出来的大量DNA与RNA、蛋白质结合在一起,即释放的不是纯净的DNA,常称为DNA核蛋白。,2.DNA与蛋白质分离。,在高浓度(2mol/L)的氯化钠溶液中,核蛋白易溶解,释放出的DNA也溶解在高浓度的氯化钠溶液中,3.DNA的析出与获取。,因为DNA在低浓度( 0.14mol/L )的氯化钠溶液中溶解度小,而蛋白质的在其中的溶解度大。所以

10、在向含DNA的高浓度的氯化钠溶液中加入大量蒸馏水稀释氯化钠溶液,从而使DNA溶解度下降,蛋白质溶解度增高。,4.DNA的再溶解。,用高浓度(2mol/L)的氯化钠溶液再溶解DNA粘稠物。,5.DNA的沉淀和浓缩。,对于除去了蛋白质的DNA的氯化钠溶液,必须再进一步沉淀和浓缩,常用酒精沉淀法。即往含有Na的DNA溶液,加入体积分数为95%的冷却酒精,混匀后可以使DNA沉淀、浓缩,形成含杂质较少的DNA丝状物,悬浮于溶液中。若丝状物较少,可将混合液再放入冰箱中冷却几分钟即可。浓缩后的DNA丝状物可以用玻棒(玻棒有吸附DNA的作用)缓缓旋转的方法卷起。,6.DNA的鉴定。,鉴定时蓝色的深浅与溶液中DNA的含量多少有关。,

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