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1、2 染色体与 DNA,2.1 染色体,2.1.1 染色体概述,染色体(chromosome)是细胞核中载有遗传信息的物质，在显微镜下呈丝状或棒状，由核酸和蛋白质组成，在细胞发生有丝分裂时期容易被碱性染料着色，因此而得名。 同一物种内每条染色体所带DNA的量是一定的，但不同染色体或不同种中间变化很大。,原核细胞染色体外裹着稀疏的蛋白质，其中一部分与DNA的折叠有关，另一些则参与DNA复制、重组及转录过程。 真核细胞的染色体中，DNA与蛋白质完全融合在一起，其蛋白质与相应DNA的质量比约为2:1。此外还有少量RNA。,人类染色体显微结构图,19 Mb 210 genes,240 Mb,3453 g
2、enes,DNA的分布,例：紫茉莉叶色的遗传,在分子生物学中，我们用“染色体DNA”，是为了区别质粒、线粒体和叶绿体DNA。 了解染色体，是为了了解DNA的存在状态，同时也是为了理解染色体水平的基因表达调控。 染色体本身也是分子生物学家的研究材料，比如针对端粒的研究。,2.1.2 真核细胞染色体的组成,染色体作为遗传物质的特征： 分子相对稳定； 能自我复制，保持遗传连续性； 能指导蛋白质合成，控制生命过程； 能产生可遗传的变异。,化学组成 (1). DNA：约占30%，每条染色体一个双链DNA分子 是遗传信息的载体，也就是所谓的遗传物质 (2). 蛋白质 组蛋白(histone)：呈碱性，结构
3、稳定；与DNA结合形成、维持染色质结构，与DNA含量呈一定的比例 非组蛋白：种类和含量不稳定；作用还不完全清楚，可能与染色质结构调节有关，在DNA遗传信息的表达中有重要作用 (3). 少量的RNA（含量小于DNA含量的10%）,1. 蛋白质,包括组蛋白（Histone）和非组蛋白。,富含赖氨酸和精氨酸,Histone were analyzed by SDS-PAGE,组蛋白的特性 1. 进化上的极端保守性 特别是H3、H4，牛、猪、大鼠的H4完全相同，牛和豌豆的H4只有两个氨基酸的差异。 2. 无组织特异性 仅发现两个例外（鸟鱼两栖红细胞H1-H5，精细胞鱼精蛋白） 3. 肽链上氨基酸分布的
4、不对称性 N端碱性氨基酸 C端疏水氨基酸 4. 组蛋白的修饰作用 甲基化、乙酰化、磷酸化、ADP核糖基化等 5. 富含赖氨酸的组蛋白H5 只存在于鸟类、两栖类等含有细胞核的红细胞中,肽链上氨基酸分布的不对称性 N端碱性氨基酸 C端疏水氨基酸,组蛋白的修饰作用影响组蛋白与DNA的亲和性，调控基因表达。,Sites of post-translational modifications on the histone tails. The modifications shown include acetylation (purple), methylation (red), phosphorylat
5、ion (green), and ubiquitination (orange). Genes 29:245-255. Greider CW, Blackburn EH. Identification of a specific telomere terminal transferase activity in Tetrahymena extracts. Cell 1985; 43:405-13. Greider CW, Blackburn EH. A telomeric sequence in the RNA of Tetrahymena telomerase required for te
6、lomere repeat synthesis. Nature 1989; 337:331-7.,四膜虫Tetrahymena,端粒长度与衰老,端粒合成模型,2 环状DNA双链的复制,型 （如大肠杆菌E. coli）,滚环型（rolling circle） 如X174,D-环形（D-loop） 如哺乳动物线粒体DNA,2.4 原核生物和真核生物DNA复制的特点,2.4.1 原核生物DNA复制的特点,1 DNA复制的引发,oriC (84min),（dnaA结合位点）,复制原点, The origin of replication,不同原核生物的复制起始位点,A bacterial artifi
7、cial chromosome (BAC) is a DNA construct, based on a functional fertility plasmid (or F-plasmid), used for transforming and cloning in bacteria, usually E. coli. F-plasmids play a crucial role because they contain partition genes that promote the even distribution of plasmids after bacterial cell di
8、vision. The bacterial artificial chromosomes usual insert size is 150-350 kbp.,扩展：BAC,The eight-plasmid pol Ipol II system for the generation of influenza A virus.,dnaA与OriC的结合启动了DNA的复制,Nature Reviews Microbiology 11,303315 (2013),HU+ATP,RNA引物：所有的DNA聚合酶都从3羟基端开始DNA合成。DNA复制首先需要由引发酶在DNA模板上合成一段RNA链，提供引发
9、末端。长度111。,引发体 primosome,引发前体 preprimosome,引发酶 Primase (DnaG),DnaB helicase DnaC helicase assistant DnaT PriA PriB PriC,2 DNA双螺旋的解旋,DNA解链酶(DNA helicase) 需要水解ATP获得能量。 大部分沿模板的5-3方向移动，少数沿3-5方向移动(Rep蛋白)。,在Ecoli中，解旋酶DnaB作为引发体的成员，参与复制叉形成，并结合于一个复制叉，利用ATP水解的能量解开双螺旋，推动复制叉向前延伸。,单链结合蛋白(single-strand binding pro
10、tein, SSB蛋白) 原核生物SSB蛋白有协同效应。 防止单链DNA退火。 使DNA单链保持一种伸展构象，它们与磷酸骨架结合，离开暴露的碱基那些碱基能作为DNA合成的模板； 使解开的单链不形成发卡结构； 保护DNA单链不受Dnase水解。,DNA拓扑异构酶(DNA topoisomerase) 第一型拓朴异构酶（Type I topoisomerase）：切断一股DNA，属于这类型的有拓朴异构酶I与拓朴异构酶III等。 第二型拓朴异构酶（Type II topoisomerase）：切断双股DNA，属于这类型的有拓扑异构酶II与拓扑异构酶II等。,扩展：TOPO Cloning,3 复制的
11、延伸,冈崎片段与半不连续复制 冈崎片段(Okazaki fragment)一般长约1000-2000个碱基，原核比真核长。,前导链 Leading strand 后随链 Lagging strand,然后，RNaseH（大肠杆菌中为DNA聚合酶I）降解RNA引物，DNA聚合酶I补齐缺口，再由DNA连接酶连接两个冈崎片段。,4 复制的终止,Tus与约22bp的终止序列Ter结合，使dnaB不再解链。 当复制叉前移，遇到重复性终止子序列（Ter）时，Ter-Tus复合物能阻挡复制叉的继续前移，等到相反方向的复制叉到达后在DNA拓扑异构酶IV的作用下使复制叉解体，释放子链DNA,PNASSeptem
12、ber 2, 2008vol. 105no. 3512831-12836,5 DNA聚合酶,所有DNA 聚合酶（无论是原核生物还是真核生物来源）共同性质： (a) 在DNA聚合酶的活性中心，在模板DNA链的指导下，按照碱基互补配对原则对新加入的碱基具有严格地选择； (b) 新和成链的延伸方向是由5 3 进行，新生链与模板链反向平行。 (c) DNA 聚合酶不能从头开始合成所有的DNA 聚合酶都需要一段寡聚核苷酸引物，（有3-OH ），在引物的3-端逐个加入新的核苷酸。,细菌中，已有五种DNA聚合酶被发现。 * DNA聚合酶I（Pol I）：C端(Klenow 片段)具有聚合酶活性和3-5外切酶
13、活性；N端具有5-3外切酶活性；能去除冈崎片段5端得RNA引物；有内切酶活性。 * DNA聚合酶II（Pol II）：活性低，在DNA损伤修复中起作用。 * DNA聚合酶III（Pol III）：活性强，具有聚合酶活性和3-5外切酶活性，在大肠杆菌DNA复制过程中起主要作用。 * DNA聚合酶IV（Pol IV）：SOS修复中发挥作用。 * DNA聚合酶V（Pol V）： SOS修复中发挥作用。,Only when a correct base pair is formed are the 3OH of the primer and the -phosphate of the incoming
14、 nucleoside triphosphate in the optimum position for catalysis to occur.,In DNA polymerase, the nucleotide binding pocket is too small to allow the presence of a 2OH on the incoming nucleotide. This space is occupied by two amino acids (discriminator amino acids) that make van der Waals contacts wit
15、h the sugar ring.,DNA Polymerase Holoenzyme Consists of Subcomplexes,A clamp loader places the processivity subunits on DNA, where they form a circular clamp around the nucleic acid. One catalytic core is associated with each template strand.,DNA polymerase III holoenzyme assembles in stages, genera
16、ting an enzyme complex that synthesizes the DNA of both new strands,clamp,The Clamp Controls Association of Core Enzyme with DNA,The core on the leading strand is processive because its clamp keeps it on the DNA. The clamp associated with the core on the lagging strand dissociates at the end of each
17、 Okazaki fragment and reassembles for the next fragment.,The dimeric polymerase model,扩展： 双链 DNA上的单链切口可以激活DNA聚合酶的的外切酶 活力，从切口的切去核苷酸，同时从切口开始合成新链，可使DNA链上切口向前推进，产生切口平移。 切口平移时，如果新掺入的脱氧核苷三磷酸为，则重新合成的新链为带有同位素标记的分子，可以用做探针进行分子杂交实验。,2.4.2 真核生物DNA复制的特点,真核生物是多点复制，原核生物是单点复制。真核生物在完成全部复制之前，各个起始点上DNA复制不能再开始；原核生物起始点上
18、可连续开始新的DNA复制。,真核生物复制 原核生物复制,复制起始位点： 自主复制序列(autonomous replicating sequence, ARS) 这个序列是染色体正常起始复制所必需的。所有的ARS的DNA均有一段保守序列。,ARS能结合起始点识别复合物(origin recognition complex, ORC)。,a | The origin recognition complex (ORC) is first recruited to the replication origin. b | ORC recruits Cdc6 and Cdt1. c | ORC, Cdc
19、6 and Cdt1 act together to load multiple minichromosome maintenance (Mcm)27 protein hexamers onto the origin, which licenses the DNA for replication. d | Initiation-competent complexes are probably formed by the back-to-back assembly of two Mcm27 complexes. As the ORC is asymmetrical, this might req
20、uire deposition of a second ORC molecule to load Mcm27 in the opposite orientation. Nature Reviews Molecular Cell Biology 6, 476-486 (June 2005),真核细胞染色体的各个区域不是全部同时复制的，期中不断有复制子被活化，直至整个染色体完全复制。 在真核生物基因组复制过程中，只有部分复制位点起作用，这可能与染色体结构、基因转录、生物发育过程、的甲基化等因素有关。 例如，动物发育过程中，细胞周期的期在胚胎期可以只有几分钟，在成熟组织中长达几小时。复制在期的及时完
21、成主要取决于有效复制起始位点的增加，而不是复制叉移动速度的增加。,已发现15种真核DNA聚合酶，在哺乳动物细胞中有5种： Pol ：做为引发酶合成RNA引物，然后做为DNA合成酶延伸此段RNA引物；合成数百个碱基后，将后续的延伸过程交给Pol 与。 Pol ：在DNA修复中起作用。 Pol ：复制线粒体DNA。 Pol ：Pol 与Pol 是真核细胞的主要DNA聚合酶。（前导链） Pol ：填补引物空隙，切除修复，重组。（冈崎片段） （真核生物DNA聚合酶一般不具有外切酶活性，推测有其他的酶参与校对。） 去除冈崎片段： 分两步，RNA酶H1切断DNA-RNA，FEN1蛋白降解RNA片段，DNA
22、连接酶连接两个冈崎片段。,2.4.3 DNA复制的调控,大肠杆菌染色体DNA的复制调控 复制起始不依赖于细胞分裂，复制终止则能引发细胞分裂。复制调控主要发生在起始阶段。 对dam- E.Coli 的研究表明，半甲基化的Ori C不能发动一轮新的复制 在复制过程中，Ori C的半甲基化状态约保留13 min。而在基因组其它区域的GATC位点，在复制后1.5 min内即被甲基化。,ColE1质粒DNA的复制调控,引物RNA前体的转录起始于复制起点上游555个核苷酸处，需经RNaseH加工后产生有555个核苷酸的引物，然后由DNA聚合酶I在引物的3末端起始DNA合成。 RNA1的编码区在引物RNA编
23、码区的5末端，转录方向与引物RNA相反，因此与引物RNA的5末端互补。 RNA1通过氢键配对与引物RNA前体相互作用，阻止了RNaseH加工引物前体，使其不能转化为有活性的引物而对复制起负调控作用。,（负调控）,当不存在RNA 1时，RNA引物前体形成自身的发夹结构，起类似终止子的作用 当前体RNA与RNA1互补配对时，类终止子效应消失，引物前体的转录被继续，阻止了RNase H加工引物前体 Rop蛋白能提高RNA1与引物前体的相互作用，从而加强了RNA1的负调控作用,3. 真核细胞DNA的复制调控 （1）细胞生活周期水平调控 DNA复制只发生在S期 S期的主要事件是DNA复制，该过程将准确生
24、成两套半保留的染色体。对此，有人提出“DNA复制执照”假说，该假说认为细胞中存在一种因子使DNA仅能复制一次。且该因子将不断降解从而使DNA复制于G2期中止，并直至下一次M期重新接触到该因子才可继续复制。有实验证明Mcm、Orc蛋白等成分构成了执照因子。 （2）染色体水平调控 不同染色体或同一染色体不同部位 的复制子按一定的时间顺序在S期起始 复制。机理还不清楚。 （3）复制子水平调控 各个复制子按专一的时间顺序活化。,The cell division cycle and its control. The cell cycle is divided into four distinct ph
25、ases (G1, S, G2, and M). The progression of a cell through the cell cycle is promoted by CDKs, which are positively and negatively regulated by cyclins and CKis, respectively. As shown, cyclin D isoforms interact with CDK4 and CDK6 to drive the progression of a cell through G1. Cyclin D/CDK4,6 compl
26、exes phosphorylate pRb, which releases E2F to transcribe genes necessary for cell cycle progression. The association of cyclin E with CDK2 is active at the G1-S transition and directs entry into S-phase. The INK4s bind and inhibit cyclin D-associated kinases (CDK4 and CDK6). The kinase inhibitor pro
27、tein group of CKi, p21Cip1/Waf-1, p27Kip1, and p57Kip2, negatively regulate cyclin D/CDK4,6 and cyclin E/CDK2 complexes. S-phase progression is directed by the cyclinA/CDK2 complex, and the complex of cyclin A with Cdk1 is important in G2. CDK1/cyclin B is necessary for the entry into mitosis. Curcu
28、min modulates CKis, CDK-cyclin and Rb-E2F complexes to render G1-arrest and alters CDK/cyclin B complex formation to block G2/M transition. Sa and Das Cell Division 2008 3:14 doi:10.1186/1747-1028-3-14,2.5 DNA的修复,维持 DNA序列的保真性； 可在复制前后进行； 有多种修复机制来纠正DNA损伤； DNA 修复失败可能导致突变和肿瘤。,怎么损伤的？,1 自发损伤 DNA复制中的错误（10-
29、1-2 - 10-5-6 - 10-10 ） DNA自发性化学变化（碱基异构、脱氨基、脱嘌呤嘧啶、碱基修饰） 2 物理因素 紫外线 电离辐射 3 化学因素 烷化剂 碱基类似物（5-溴尿嘧啶） EB,mismatch repair (MMR) A type of repair that corrects mispaired bases, typically immediately following replication. The process preferentially corrects the sequence of the daughter strand by distinguish
30、ing the daughter strand and parental strand, sometimes on the basis of their states of methylation.,The human genome has many repair genes,修复方式概览,2.5.1 错配修复,2.5.2 切除修复,AP位点 所有细胞中都带有不同类型、能识别受损核酸位点的糖苷水解酶，它能够特异性切除受损核苷酸上的N-糖苷键，在DNA链上形成去嘌呤或去嘧啶位点，统称为AP位点(apurinic/apyrimidinic site) 。 AP位点 AP核酸内切酶 DNA聚合酶I
31、DNA连接酶,1. 碱基切除修复,2. 核苷酸切除修复,2.5.3 重组修复,有时在进行DNA修复之前，受损环的DNA链常常还能进行复制。在这种情况下，受损亲代链的复制受损坏碱基的干扰，跨过这段损坏序列后，此时在新的一个起点继续开始复制，此时新合成的子代链的碱基序列就有了一个缺口。这种缺口可以通过重组修复机制纠正。这种修复机制有点类似于遗传重组。 当进行第二轮复制时，如果损伤还留在母链上，仍会给复制带来困难，复制经过损伤部位时所产生的缺口还需通过同样的重组过程来弥补，直至损伤被切除修复所消除。但是，随着复制的不断进行，若干代后，即使损伤始终未从亲代链中除去，而在后代细胞群中也已被稀释，实际上消
32、除了损伤的影响。,2.5.4 DNA的直接修复,2.5.5 SOS反应,SOS修复（SOS response）是指DNA受到严重损伤、细胞处于危急状态时所诱导的一种DNA修复方式，修复结果只是能维持基因组的完整性，提高细胞的生成率，但留下的错误较多，故又称为错误倾向修复（error-prone repair），使细胞有较高的突变率。 在SOS修复中，可以诱导产生校对功能低的DNA聚合酶和，合成的新的DNA链是不忠实的，有许多不配对的碱基，而复制仍可进行。往往导致突变的产生，但对细胞来说，比根本不能存活要好。在此情况下允许错配可增加存活的机会。,Damage to DNA causes RecA
33、 to trigger the SOS response, which consists of genes coding for many repair enzymes. RecA activates the autocleavage activity of LexA. LexA represses the SOS system; its autocleavage activates those genes.,LexA and RecA have a reciprocally antagonistic relationship,RecA Triggers the SOS System,SOS
34、response in E.coli,2.6 DNA的转座,转座子的定义: 能将自身插入基因组新位置的DNA序列。,2.6.1 转座子的分类和结构特征,每个IS转座频率是10-410-6/世代，恢复频率则低得多，约为10-1010-6/世代。,插入序列 （insertional sequence, IS）,（1）含短的末端反向重复序列; （2）含编码转座酶的基因; （3）靶位点存在 5-9 bp 的短正向重复序列。,插入序列的结构特征,2. 复合型转座子（composite transposon）,The order of events and exact nature of the conn
35、ections between transposon and target DNA determine whether transposition is replicative or nonreplicative.,Transposon is copied to new site,Transposon moves to new site,2.6.2 真核生物中的转座子,2.6.2 真核生物中的转座子,自主性转座子（autonomous transposon）：具有自主剪接和转座功能。 非自主性转座子（nonautonomous transposon）：单独存在时不能转座，当基因组中存在同家族的
36、自主转座子时，才具备转座功能。 玉米中研究比较清楚的是Ac-Ds系统（activator-dissociation system），即激活-解离系统，它通过非复制型机制进行转座。,Ac stands for activator element Ds stands for dissociative element Barbara McClintock showed that-transposition of the Ds element altered kernel coloration-movement of the Ds element required the activity of Ac
37、 element,Ac-Ds Elements in Corn,Transposition of Ds Element Disrupts Gene Controlling Kernel Color,Excision of Ds Element Leads to Variegated Kernels,2.6.3 转座作用的机制,复制型：复制粘贴 非复制型：剪切粘贴,复制型（右） 非复制型（下）,2.6.4 转座作用的遗传学效应,转座引起插入突变 转座产生新的基因 转座产生染色体畸变 转座引起生物进化,Inverted repeat recombination inverts material,D
38、irect repeats recombine to excise material,2.5 SNP理论与应用,单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）：是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸的突变而引起的多态性。 A SNP is defined as a single base change in a DNA sequence that occurs in a significant proportion (more than 1 percent) of a large population.,2.7.1 SNP概述 主要是指在基因组水平上由单个
39、核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种。占所有已知多态性的90%以上。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每5001000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。 SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转换（transition）或颠换（transversion）所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。但通常所说的SNP并不包括后两种情况。 理论上讲，SNP既可能是二等位多态性，也可能是3个或4个等位多态性，但实际上，后两者非常少见，几乎可以忽略。因此，通常所说的SNP都是二等位多态性的。 根据SNP在基因中的位置，可分为基
40、因编码区SNPs（Coding-region SNPs，cSNPs）、基因周边SNPs（Perigenic SNPs，pSNPs）以及基因间SNPs（Intergenic SNPs，iSNPs）等三类。,2.7.2 SNP的检测技术 基因芯片技术 Taqman技术 分子导标技术 焦磷酸测序法,基因芯片技术,Taqman技术,分子信标 Molecular beacon,焦磷酸测序法 Pyrosequencing,2.7.1 SNP的应用 Genome of each individual contains distinct SNP pattern. People can be grouped based on the SNP profile. SNPs Profiles important for identifying response to Drug Therapy. Correlations might emerge between certain SNP profiles and specific responses to treatment.,