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1、工艺技术食品科学2009, Vol. 30, No. 1261超声波辅助酶法水解玉米蛋白的工艺研究刘振春，邓子瑜，李 慧，段 绪(吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林 长春130118)摘 要：本实验对玉米蛋白在碱性条件下的酶解工艺进行研究，提出一种超声波预处理和碱性蛋白酶酶解相结合的方法，可在短时间内提高产品得率。通过单因素试验及正交试验的考察，超声波辅助酶法水解玉米蛋白的最佳工艺为：超声波预处理时间 4min、底物浓度 2%、酶浓度 5%、pH10.5、温度 55。在此条件下，玉米蛋白的水解度为 61.47%。关键词：玉米蛋白；水解度；超声波Ultrasonic-assisted Enzy
2、matic Hydrolysis of Corn ProteinLIU Zhen-chun，DENG Zi-yu，LI Hui，DUAN Xu(College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun130118, China)Abstract ：The present study aimed to develop a combination method of ultrasonic pre-treatment and alkaline protease-catalyzed hydroly
3、sis for corn protein. The ultrasonic-assisted enzymatic hydrolysis was optimized through orthogonal test design based on single factor test. When ultrasonic treatment duration, mass fractions of substrate and enzyme, and pH value and temperature for hydrolysis were 4 min, 2% and 5%, and 10.5 and 55
4、, respectively, the maximum hydrolysis degree was achieved, reaching 61.47%. Moreover, molecular weights of products obtained at different hydrolysis time were determined by SDS-PAGE.Key words：corn protein；hydrolysis degree；ultrasonic中图分类号：TS210.1文献标识码：A文章编号：1002-6630(2009)12-0061-05玉米蛋白粉是玉米淀粉与淀粉糖工业
5、生产中重要的白及酪蛋白可以释放出抗高血压活性的小肽 6 ；用胃蛋副产品之一，含蛋白质 6 0 % 左右，其余是 2 0 % 淀粉、白酶等水解动物乳清蛋白可得到具有抗菌作用的活性肽7。13% 纤维素、VA 等多种营养物质，还含有 15 种矿物盐制备蛋白水解物的工艺包括预处理、水解、脱以及玉米独有的黄色素 1 。苦、脱色、脱盐、浓缩及干燥等步骤，其中，水解目前，玉米蛋白主要应用在制取玉米黄色素、制最为重要。 超声波辅助提取具有节时、节能、节料、取玉米醇溶蛋白、提取谷氨酸、制备玉米蛋白活性肽、破壁、得率高的特点。利用超声波技术对玉米蛋白进制备谷氨酰胺肽、制备高 F 值低聚肽、制备降血压肽行预处理，可
6、大大提高玉米蛋白的水解度。本研究拟和玉米蛋白肽等方面 2 。使用超声波技术和蛋白酶水解处理原料，并对其工艺进玉米蛋白水解后的异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸和行优化设计，以期为生产玉米淀粉行业副产品的综合利丙氨酸等疏水性氨基酸和脯氨酸、谷氨酸等含量很高，用探索出一条新的途径。很少含赖氨酸、色氨酸等必需氨基酸3 。这种独特的氨1材料与方法基酸结构营养价值不高，但通过生物工程处理，控制一定水解度可获得具有多种生理功能的活性肽4 。1.1材料与试剂经过水解的蛋白一般都能增加其在水中的溶解度、玉米蛋白粉(80 目，食品级)中粮集团。降低黏度、增加流动性、热稳定性、易被人体吸收，中性蛋白酶、木瓜蛋白酶广西南宁庞
7、博生物工降低食品的抗原性。一些原来隐藏于蛋白质分子内部的程有限公司；丙酮、正己烷、 9 5 % 乙醇、乙醚、三具有特定氨基酸序列的段被释放出来，形成具有各种不氯甲烷、甲苯、氯仿、环己烷、硫酸钾、亚硫酸钠、同生理活性的小肽分子5 。例如酶解玉米蛋白、大豆蛋柠檬酸、乙酸锌、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、SDS 、收稿日期：2008-09-20基金项目：吉林省科技厅资助项目(20060220)作者简介：刘振春(1963-)，男，教授，博士，研究方向为食品营养与功能性食品。E-mail：622009, Vol. 30, No. 12食品科学工艺技术- 巯基乙醇、T r i s 、甘氨酸、考马斯亮蓝 R -
8、 2 5 0 、冰醋酸、甲醇、甲酸、正庚烷、正丁醇等均为分析纯。1.2仪器与设备GB204 电子天平；SHA-B 水浴恒温振荡器；JY99-2D 超声波细胞粉碎机；BUCHI B-820 型脂肪测定仪； DYY-12 稳压直流电泳仪；MB45 红外水分测定仪；TU-1810 紫外可见分光光度计；GZX-9240MBE 电热恒温鼓风干燥箱；RE-52AA 旋转蒸发仪；SHZ- 型循环水真空 泵 。1.3方法1.3.1玉米蛋白酶解实验玉米蛋白粉和水按 1:10(m/m)的比例混合，用 4mol/L NaOH 调 pH9.0，加碱性蛋白酶(10 万 U/ml)酶解 1h 后，90灭酶 15min，用
9、 5mol/L HCl 调 pH7.0，6000D 超滤膜超滤，将超滤液喷雾干燥得玉米短肽干粉备用。在前期实验的基础上，选取对水解度影响较大的温度、p H 值、底物浓度、酶浓度进行正交试验，选出最优组合，测定其水解度，与超声波辅助玉米蛋白酶解实验结果进行对比。1.3.2超声波辅助玉米蛋白酶解实验8,10玉米蛋白粉和水按 1:10(m/m)的比例混合，利用超声波细胞破碎 5min，55水浴搅拌，用 4mol/L NaOH 调pH9.0，加碱性蛋白酶(10 万 U/ml)酶解 1h 后，90灭酶15min，用 5mol/L HCl 调 pH7.0，6000D 超滤膜超滤，将超滤液喷雾干燥得玉米短肽
10、干粉备用。对影响玉米蛋白水解的蛋白酶种类、底物浓度、水解温度、p H 值、水解时间、超声波功率、作用时间以及酶浓度等单因素进行研究，根据单因素试验结果，以超声波时间、p H 值、底物浓度和酶浓度为因素，做正交试验，以确定超声波辅助酶法的最佳水解条 件 。1.3.3水解度(DH)的测定9所谓蛋白质的水解度(degree of hydrolysis，DH)是指蛋白质中的肽键被水解的百分数，其计算公式为：hDH(%) 100htot式中：h 为蛋白质水解后每克蛋白中被裂解的肽键的毫摩尔数(mmol/g 蛋白质)；htot 为每克原料蛋白中肽键的毫摩尔数(mmol/g 蛋白质)。水解开始时， 调节反应
11、体系的 pH 值为 9.0，反应结束后测定反应体系的 pH 值，用 0.5mol/L NaOH 将反应体系的 pH 值调到原来的 pH 值，记录下所用的碱液的量，按下式即可计算出玉米蛋白的水解度：111DH(%) B Mb 100 Mp htot式中：B 为 NaOH 的体积(ml)；Mb 为 NaOH 的浓度(mol/L)；在 pH9.0、50的实验条件下，对于玉米蛋白为 1.01；Mp 为蛋白质的质量(g)；htot 为每克原料蛋白质肽键的毫摩尔数(mmol/g 蛋白质)，对于玉米蛋白，该值取 9 . 2 。1.3.4玉米蛋白水解物分子量的测定11玉米多肽分子量分布采用 SDS-PAGE
12、电泳法测定。1.3.5酶活力测定方法12蛋白酶活力为 1g 固体酶粉(或 1ml 液体酶)，在一定温度和 pH 值条件下，1min 水解酪素产生 1g 酪氨酸为一个酶活力单位，以 U/g 表示。根据参考文献12采用紫外分光光度法测定。2结果与分析2.1最佳酶的选择本实验选择了 4 种不同的酶，比较了各种酶的水解能力，确定最佳用酶 。 实验结果见表 1 。表 1 不同酶水解玉米蛋白的水解度 Table 1 Hydrolysis degrees of corn protein by various enzymes under the optimum hydrolysis conditions酶的种
13、类pH温度()DH(%)碱性蛋白酶105522.96中性蛋白酶6.54510.5木瓜蛋白酶7.0377.5胃蛋白酶2255.5由表 1 可知，在酶用量相同(6%)、酶活力(10000U/ g)的情况下，测得几种酶水解玉米蛋白的能力依次为：碱性蛋白酶中性蛋白酶木瓜蛋白酶胃蛋白酶。碱性蛋白酶催化玉米蛋白粉的水解度较大，这是因为玉米蛋白在碱性溶液中的溶解性较大，从而酶和蛋白能充分地接触并进行水解。而且，碱性蛋白酶对疏水性基团较多的蛋白有较强的作用 1 2 。因此，本实验选用碱性蛋白酶为实验用酶。2.2超声时间的确定固定酶的反应条件，对玉米蛋白粉溶液进行超声波处理，功率由设备自动调节，超声时间 1 、
14、2 、3 、4 、 5 、10 、15 、20 、25 、30min 后进行水解，并测其水解度，试验结果见图 1 。由图 1 可以看出，13min 范围内，随着超声时间的延长，水解度逐渐增大，当时间超过 5min 后，水解度大幅度下降，这可能由于蛋白质过度变性，导致水解度降低，说明预处理的时间不是越长越好，因此，工艺技术食品科学2009, Vol. 30, No. 1263超声时间不应太长，选择 5 m i n 为宜。3530(%)水解度2520151050010203040超声时间(min)图 1不同超声时间对水解度的影响Fig.1Effects of ultrasonic treatmen
15、t duration on hydrolysis degreeof corn protein by alkaline protease2.3超声条件下水解时间的确定选择超声波预处理过的玉米蛋白水溶液，固定其他酶反应条件，调整水解时间分别为 0 . 5 、1 、1 . 5 、2 、3 、 4 、 5 、 6 h ，试验结果见图 2 。3530(%)水解度252015105024680时间(min)图 2水解时间对水解度的影响Fig.2 Time course of alkaline protease-catalyzed hydrolysis ofultrasonic-pretreated cor
16、n protein由图 2 可以看出，在反应最初的 1 h 内，水解度增加幅度较大，1 h 后，水解度趋于恒定。这可能由于经过超声波预处理，玉米蛋白长链断开，使玉米蛋白的高度压缩、紧密的结构松散开，使水解速度加快、水解时间缩短，故选择 1 h 为最佳。2.4超声波条件下 pH 值的确定选择超声波预处理过的玉米蛋白水溶液，固定其他酶反应条件，调整水解体系的 pH 值分别为 8、8.5、9、9 . 5 、1 0 、1 0 . 5 、1 1 ，试验结果见图 3 。3530(%)水解度252015105088.599.51010.511pH图 3pH 值对与水解度的影响Fig.3 Effects of
17、 pH value on hydrolysis degree of ultrasonic-pretreated corn protein by alkaline protease由图 3 可以看出，pH 值为 8 时，水解度比较低，随着 p H 值的增加，水解度也大幅度的增大，这可能是由于达到了酶的最适 pH 值，当 pH 值为 10.5 时达到最大值。 2.5 超声波条件下底物浓度对水解度的影响选择超声波预处理过的玉米蛋白水溶液，固定其他酶反应条件，选择底物浓度为 2 % 、4 % 、6 % 、8 % 、 1 0 % 、1 2 % 进行水解，试验结果见图 4 。4540(%)水解度35301
18、52520105024681012底物浓度(%)图 4底物浓度对水解度的影响Fig.4 Hydrolysis degrees of corn protein (pretreated by ultrasonic, and then hydrolyzed by alkaline protease) at different mass fractions由图 4 可以看出，随着底物浓度的增加，水解度逐渐下降，底物浓度为 2 % 时，水解度最大 。2.6超声波条件下酶浓度对水解度的影响选择超声波预处理过的玉米蛋白水溶液，固定其他酶反应条件，选择酶浓度为 1%、2%、3%、4%、5%、6 % 、7 %
19、进行水解，试验结果见图 5 。3530(%)水解度25201510502345671酶浓度(%)图 5酶浓度对水解度的影响Fig.5 Effects of mass fraction of alkaline protease on hydrolysisdegree of ultrasonic-pretreated corn protein由图 5 可以看出，随着酶浓度的增加，水解度逐渐上升，当酶浓度达到 6 % 时，水解度最大，大于 6 % 时水解度反而降低。因此，酶浓度为 6 % 时为最佳。 2.7 超声波辅助玉米蛋白酶解最佳水解条件优化根据单因素试验结果，选择超声波时间、p H 值、酶浓度
20、、底物浓度为因素，根据单因素试验结果及有关资料，进行了四因素三水平正交试验，试验结果见表 2 。由表 2 的分析结果可以看出，在影响水解度四个因素中，各因素对水解影响的大小顺序为：A C D B ，642009, Vol. 30, No. 12食品科学工艺技术最终确定水解条件的最优组合为 A2B3C1D2，即超声时间4min，pH 值为 10.5，底物浓度为 2%，酶浓度为 5%，在此条件下得到的水解度为 61.47%。表 2 L9(34)超声波辅助碱性蛋白酶水解玉米蛋白正交试验结果 Table 2 Results of orthogonal test for optimizing ultra
21、sonic-assisted alkaline protease-catalyzed hydrolysis of corn protein and range analysis试验号A 超声B pHC 底物浓度D 酶浓度水解度时间(min)(%)(%)(%)11(3)1(9.5)1(2)1(4)37.73212(10)2(4)2(5)36.09313(10.5)3(6)3(6)39.3642(4)12334.465223132.826231261.4773(5)13227.898321330.579332137.72K1113.18100.08129.77108.27K2128.7597.30
22、108.27125.45K396.1899.48100.07104.39k137.7233.3643.2636.09k242.9232.4336.0941.82k332.0633.1633.3634.80R10.860.939.907.02由表 3 可见，各因素对水解影响的大小顺序为：温度 p H 值底物浓度酶浓度，确定水解条件的最优组合为：温度 5 5 ，p H 1 0 ，底物浓度 6 % ，酶浓度4%，在此条件下得到的水解度为 41.76%。可见超声波辅助提取，提高了玉米蛋白的水解度，效果优于单纯的碱性蛋白酶水解效果。2.9玉米蛋白水解物分子量玉米蛋白水解产物的分子量分布将直接影响产物的应
23、用，因此需对玉米蛋白水解产物的分子量分布进行测试。利用 S DS - 聚丙烯酞胺凝胶电泳法测定水解产物的分子量，以产品编号 B022 的预染窄谱蛋白分子量标准为分子量参照物，考察不同的水解时间下，水解产物分子量的差异。从图 6 可以看出：第 2 、3 条泳道中的条带显示，水解液的分子量小于 5000D，分子量染色处颜色较浅，证明肽含量较小；第 4 、5 泳道分子量染色处颜色加深，即肽的含量增加；第 6 8 条泳带中显示肽的分子量小于 2000D；第 10 条泳道条带中显示肽的分子量小于 1000D，同时分子量染色处颜色深，即肽的含量较高。2.8超声波辅助玉米蛋白酶解与玉米蛋白酶解对比为与超声波
24、辅助实验进行对比，进行了碱性蛋白酶水解玉米蛋白的实验。在前期实验基础上，选择水解参数 p H 值、温度、酶浓度、底物浓度为影响因素，进行了四因素三水平的正交试验，以水解度来评价水解效果 。 试验结果见表 3 。表 3 L9(34)碱性蛋白酶水解玉米蛋白正交试验结果 Table 3 Results of orthogonal test for optimizing alkaline protease-catalyzed hydrolysis of corn protein and range analysis试验号A 温度B pHC 底物浓度(%)D酶浓度(%)水解度(%)11(55)1(9)1
25、(2)1(3)31.91212(9.5)2(4)2(4)35.18313(10)3(6)3(5)41.7642(60)12327.825223140.116231231.173(65)13224.528321333.559332125.35K1108.8584.2596.5697.37K299.03108.8488.3590.8K383.4298.21106.39103.13k136.2828.0832.1932.46k233.0136.2829.4530.27k327.8132.7435.4634.38R8.478.26.014.11从左至右，共有 10 条泳道，第 1 条泳道代表标准蛋白分
26、子量标准(Marker)从上至下分别代表 85、51、31、23、15、8、2kD；第 2、3 条泳道代表水解 0.5h 超声波辅助玉米蛋白水解液；第4、5 条泳道代表水解 1h 超声波辅助玉米蛋白水解液；第 68条泳道代表水解 2h 超声波辅助玉米蛋白水解液；第 10 条泳道代表水解 3h 超声波辅助玉米蛋白水解液。图 6水解产物的电泳图谱Fig.6SDS-PAGE pattern of alkaline protease-catalyzed hydrolysisproducts of corn protein at different hydrolysis time水解产物的分子量小于 5
27、000D，没有固定的分子量分布，这是因为水解反应是连续的。从条带还可以看出，随着标准分子量从大到小，样品水解时间的增加，条带上的颜色逐渐加深，说明小肽的含量也逐渐增大。3结论3.1 本实验以碱性蛋白酶为实验用酶，可显著提高玉米蛋白的水解度，酶的用量少，使用浓度低，有利于生产。通过正交试验设计，证明在影响水解度四个因素中，各因素对水解影响的大小顺序为：温度 pH 值底物浓度酶浓度，确定水解条件的最优组合为：温度 5 5 ，p H 1 0 ，底物浓度 6 % ，酶浓度 4 % ，在此条件下得到的水解度为 41.76%。工艺技术食品科学2009, Vol. 30, No. 12653.2 利用超声波
28、细胞破碎对玉米蛋白进行预处理，可显著地对玉米蛋白进行破壁，有利于酶发挥水解作用，提高了玉米蛋白的水解度，并且缩短了水解时间。选取超声波时间、 p H 值、底物浓度、酶浓度为因素，进行正交试验，试验结果表明：各因素对水解影响的大小顺序为：超声时间底物浓度酶浓度 p H 值。最终确定水解条件的最优组合为超声时间 4min、pH10.5、底物浓度 2 % 、酶浓度 5 % ，在此条件下得到的水解度可达到 61.47%，对玉米蛋白的水解效果明显优于单纯酶解效果。3.3 利用 SDS- 聚丙烯酞胺凝胶电泳法测定水解产物的分子量，以产品编号 B022 的预染窄谱蛋白分子量标准为分子量参照物，考察不同的水解
29、时间下，水解产物的分子量的差异不同。试验表明：随着水解时间的增加，条带上的颜色逐渐加深，水解产物的肽平均分子量降低，未水解的蛋白或大肽分子和氨基酸只占少数，小肽分子的数量增加。参考文献：1 刘振春, 张岚. 微波酶法提取玉米蛋白粉中黄色素的研究J. 食品科学, 2008, 29(1): 169-172.2 焦迎寿, 郑晓为. 活性肽在食品中的应用研究J. 粮油与食品科技, 2002(8): 35-37.3 李艳丽. 玉米肽的制备、特性及活性研究D. 长春: 吉林农业大学, 2003.4 何东平, 张世宏, 姚理, 等. 复合玉米肽片的研制J. 粮油加工与食品机械, 2005(11): 86-8
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