中低压制备色谱.ppt

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1、中低压制备色谱,俄国科学家 M. S. Tswett,色谱分离的机理,流动相（Mobile Phase） 固定相（Stationary Phase） 样品（溶解于流动相中的溶质）,薄层色谱（TLC）是化学工作者检测、鉴定混合物组分的一种简单、快捷而低廉的方法，是基于混合物中各组分与流动相和固定相作用力存在差异使得它们保留时间不同而完成分离。,薄层色谱层析（TLC),Lo,L,比移值：Rf = L / Lo,薄层色谱的核心是展开剂的选择问题，选择展开剂之前，要对各组分所有的物质有详细的了解，包括： 所含化合物的数目； 化学结构和分子量； PKa值和UV谱图； 在样品中的浓度范围和溶解度。,薄层色

2、谱的主要用途： 跟踪化学反应，判断化学反应是否已进行完全； 粗略检测试剂和原料的纯度； 粗略检测产品的纯度； 为柱色谱摸索条件。,2,1,4,3,7,6,5,8,酸性角 （质子给予）,碱性角 （质子接受）,偶极角 （偶极作用）,溶剂选择性分类三角形图,展开剂的选择,1 ：甲乙醚、乙醚 2 ：甲醇、乙醇 3 ：DMF、THF 4 ：乙二醇、乙酸,5：CH2Cl2、二氯乙烷 6 ：乙酸乙酯、乙腈 7 ：芳烃、芳醚 8 ：三氯甲烷、水,斯奈德（Snyder）的溶剂选择型分类三角图，根据溶解度数据推导出来，因此可以度量分配色谱的溶剂强度。溶剂由于偶极性和酸碱性的不同，在流动相中对所分离的样品就会程现出

3、不同的分离效果，酸性溶剂靠近酸性角，碱性溶剂靠近碱性角，偶极起主要作用的溶剂则靠近偶极角。处于同一组中的各个溶剂的极性参数相同，在色谱中具有相似的选择性，而处于不同组别的溶剂，其选择性相差较大。 例如： 化合物在四氢呋喃（3）中分离效果差，如果要改善分离效果，就最好从二氯甲烷（5） 、甲苯（7） 、三氯甲烷（8）中选择，而乙醚（1） 、甲醇（2） 、乙酸乙酯（6）效果就相对较差。,Snyder 溶剂图,DCM,MEK,EtOH,EtOH 7 Hex 3,MEK 9 H2O 1,5:5,Give up,Give up,EA,1：多种溶剂对待分物进行爬板研究，发现在乙醇中各组分爬的高而分不开，在丁

4、酮中各组分爬的低而分不开，只有二氯甲烷极性适中，但是只能分开最下面的点，上面的部分不能有效分开。 2：通过增加其它溶剂降低乙醇或增强丁酮的极性，选择合适的溶剂体系，使极性与二氯甲烷极性相同。7:3的乙醇/正己烷体系，最上面的点和其余组分能够有效分开，但其余各组分相互之间不能分开。9:1的丁酮/水体系，极性合适，但各组分仍不能分开。 3：鉴于第一步和第二步的分离情况，二氯甲烷体系中最下面点分离最好，7:3的乙醇/正己烷体系上面点分离最好，就采用它们作为溶剂体系进行分离研究，研究后发现，这两种体系在5:5的比例混合后效果最好。 最终确定采用乙醇、正己烷、二氯甲烷三元体系可以将待测样品完全分开。,常

5、用溶剂,硅胶类正相色谱中，混合溶剂的溶剂强度计算公式：Strength=1E1+2E2+,常用（TLC）的展开方法, 一般用 EA：PE (1： 16； 1：8； 1：6； 1：2； 1：1； 2：1； 3：1； 1：0) 对于在EA/PE 里不溶解的化合物，可以用CH2Cl2代替以上的PE，但是EA的用量必须减半才能到达同样的Rf值。 极性较大的化合物： MeOH：CH2Cl2 (2.5：100； 5：:100； 10：100). MeOH量一般不超过10%，否则SiO2会溶解的。 碱性化合物：NH4OH：MeOH：CH2Cl2 (0.5：5：100； 0.5：10：100). NH4OH是

6、浓氨水。最好先混合NH4OH和MeOH，再加CH2Cl2。 酸性化合物：AcOH：MeOH：CH2Cl2 (1：5：100； 1：10：100) 极性非常大的的化合物：H2O：AcOH：MeOH：CH2Cl2 (1：2.5：20：100)。 这个条件什都能展开！但只适合于TLC。在SiO2柱上会溶解SiO2的。,硅胶色谱中常用的TLC展开剂,柱色谱层析,柱色谱是薄层色谱的发展，根据薄层色谱的分离条件，可以设计出柱色谱的分离条件。柱色谱包括色谱柱和填料等，其中色谱柱按材质分为不锈钢柱、玻璃柱、PP柱等，主要选择参数是色谱柱的内径和长度。在现代制备色谱中, 分离效果好坏很大程度上取决于色谱填料的选

7、择.,正相：硅胶，或者是硅胶键合基团CN(腈基)、DIOL（二醇基）、NH2（氨基）等。 反相：C18（十八烷基）、C8（辛烷基）、C2（乙基）、CH（环己烷基）、PH（苯基）都是反相固定相。 氨基取代填料：碱性化合物的分离(不能用于醛/酮以及能与氨基反应的化合物). 硅酸镁填料：纯化酸敏感性化合物和弱碱性化合物，特别是保护基团（如TMS） 氧化铝填料：碱性、中性、酸性 大孔树脂：一般用于天然产物的初步分离。 离子交换树脂：离子交换树脂主要用与生物碱的富集,柱填料对选择性的影响,Normal Phase Column Solvents: Hexane/EtOAc,Basic Alumina C

8、olumn Solvents: Hexane/EtOAc,柱填料对选择性的影响,Normal Phase Column Solvents: Hexane/EtOAc,Amine Column Solvents: Hexane/EtOAc,柱填料对选择性的影响,RPC,C18-1,C18-2,C18-3,装柱,装柱一般分为干法装填和湿法装填，总的原则是装填结实、高度适中、表面平整。 密度：不结实影响柱效 高度：15cm，长则扩散或拖尾，短柱效低 表面：平整，不平样品走不平,干法装填：简便，易产生气泡 湿法装填：无气泡，装填时阻力大 中压色谱系统所用硅胶相对粒径较细，一般采用干法装填。硅胶一定要填

9、结实、平整；一定要用较多的溶剂“走柱子”，一定要到柱子的下端不再发烫，恢复到室温后再撤去压力。反相填料采用一般湿法装填，待在甲醇中超声脱气后，再装填结实平整即可。,上样,干法：样品拌在硅胶中，铺在填料的表面。低沸点溶剂中胶的质量 是 样品质量的1.2-1.5倍，旋干后，不能看到明显的固体颗粒。 湿法：将液体或溶液样品直接加在填料的表面。且对于液体样品或 粘稠状半固体样品只能采用湿法上样。 干法或湿法装柱都要求尽可能薄的平铺在硅胶上，太厚会造成分离效果差或分不开样品。,柱色谱上样量计算,柱色谱上样量与柱填料量的最佳比值也可通过薄层色谱实验确定。 首先确定最佳上样液浓度。 在薄层色谱以能够不使样品

10、点因过载而严重拖尾导致分离失败的最高浓度为最佳上样液浓度。 接着计算薄层色谱板上的有效硅胶体积。 计算公式为长宽厚，其中长为基线到溶剂前沿的长度，宽为样品点的最大宽度，厚为薄层色谱板的硅胶厚度。通常硅胶填料的平均密度为0.5g/cm3。 最后由最佳点样质量和有效硅胶体积，计算出样品质量与硅胶质量的最佳比值。 转化为柱色谱条件时，我们将样品质量与硅胶质量的比值保持不变,例如：最佳上样体积为0.002mL，薄层板硅胶厚度是0.25mm，样品点最大宽度为5mm，基线到溶剂前沿的长度为70mm。 薄层色谱的有效硅胶质量为：0.025cm0.5cm7cm/0.5gcm-3=0.175g 则样液体积比硅胶

11、质量的比值为：0.002mL/0.175g=0.05mL/g 对于填料为30g的色谱柱，上样量为：0.05mL/g30g=1.5mL,推荐上样量,流动相选择,由于流动相对组分有亲和力，并参与固定相对组分的竞争。因此，正确选择流动相直接影响组分的分离度。对流动相溶剂的要求是： （1）溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选择性。 （2）溶剂要与检测器匹配。对于紫外吸收检测器，应注意选用检测器波长比溶剂 的紫外截止波长要长。所谓溶剂的紫外截止波长指当小于截止波长的辐射通过溶剂时，溶剂对此辐射产生强烈吸收，此时溶剂被看作是光学不透明的，它严重干扰组分的吸收测量。 （3）高纯度。由于高效液相灵敏

12、度高，对流动相溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪峰”。痕量杂质的存在，将使截止波长值增加50-100nm。 （4）化学稳定性好。不能选与样品发生反应或聚合的溶剂。 （5）低粘度。若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、乙醇、乙晴等。但粘度过于低的溶剂也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它们易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离。,柱色谱压力模式,常压： 常压柱是效率最高的，但是时间也最长。比如天然化合物的分离，一个柱子几个月也是有的。 减压： 能够减少硅胶的使用量，溶剂挥发量加大，有些比较易分解的东西可能得不到，水泵抽气耗时且噪音大。 加压： 加快洗脱

13、剂的流速，提高分离速度；允许在分离过程中使用颗粒度更小的吸附剂，从而获得更高的分辨率；敏感化合物在进行长时间的常压色谱分离时，其结构可能会发生变化，缩短分离时间的最大优点在于可以避免这种变化的发生。,柱色谱建立,柱色谱的方法通常是根据薄层色谱的结果建立的。柱色谱的洗脱剂通常与薄层色谱的展开剂采用同种溶剂，只是根据需要改变组成比例。,Rfa = a/c Rfb = b/c CV = 1/Rf CV是把一成分从柱中洗脱出来所需要柱体积的数目，和柱子的大小无关。柱体积是填料所占柱管体积的几何体积。,CV = CVa - CVb = 1/Rfa - 1/Rfb 一般来说，只有CV大于1时，二者在柱色谱

14、中才可以完全分离。实际操作时，当溶剂流过一个柱体积时，样品在色谱柱内移动的相对值往往大于Rf，因此CV往往小于计算值，这要求我们在设计色谱条件时更应加大CV的计算值。在理想的快速色谱分离中，待分离的化合物应该在3-6个柱体积内洗脱下来，并且，两个相互分开的物质，洗脱的柱体积应该在1以上。 由于不同生产厂商的生产的硅胶的相对的湿度、颗粒度大小和结合剂的不同，有时候的最佳TLC分离条件并不能直接应用到快速色谱分离。在实际工作中，应该考虑这些因素的影响，建议使用同一生产厂家的统一规格的固定相，流动相的租成比例应以体积比为准，和快速色谱系统的表示方式一致。,Rf和CV关系表,洗脱方式,洗脱方式分为等度

15、洗脱、台阶梯度洗脱、线性洗脱、台阶/线性洗脱 等度洗脱：等度洗脱是分离中使用恒定组成的是最常用的办法，可以分离许多类型的化合物。 台阶梯度洗脱：台阶梯度洗脱适用分离复杂样品，在台阶是洗脱中，一系列恒定组成的溶剂以不连续的台阶分段对柱淋洗，可以缩短纯化周期，减少溶剂消耗。 线性洗脱：在快速色谱纯化中，线性洗脱是最常用的，现行梯度洗脱是，溶剂极性随时间连续变化，可以使柱分离加快，是纯化工作更简单，更快捷。 台阶/线性洗脱：方法的结合可以分离最复杂的样品，洗脱方式的连 用，可提高分离度，缩短分离时间，降低最小检测量，提高分离精度，对于复杂混合物、特别是保留值相差较大的混合物的分离是极为重要的手段。,

16、Cartridge: FLASH 12+S (12 x 75 mm) Eluent:A) Hexane B) EtOAc Gradient:Linear, 5%B to 100%B in 60 mL (10 CV) Flow rate:13 mL/min Load:50 mg # CV:10,Linear,Cartridge: FLASH 12+S (12 x 75 mm) Eluent:A) Hexane B) EtOAc Gradient:Step 1 - 20%B for 60 mL Step 2 - 75%B for 30 mL Flow rate:13 mL/min Load:50

17、mg # CV:15,2,3,1,Step,15,Isocratic,%B,75%,20%,0%,100%,10,CV,Step,Cartridge:FLASH 12+S (12 x 75 mm) Eluent:Hexane/EtOAc 80:20, isocratic Flow rate:13 mL/min Load:50 mg # CV:30,Isocratic,影响分离度的因素：K、及N,分离度方程： K 是容量因子，表达了被分离组分与柱填料之间作用的强弱 是分离因子，描述两个被分离组份分离的好坏程度，是化学因素 N 是理论塔板数，描述色谱峰谱带展宽的程度,初始,k、N、对分离的影响,增

18、大k,增大N,t,改变,S,t,N 理论塔板数：分离效率的量度,PW = .5,PW = 2,峰宽与塔板数的关系,理论塔板数,峰宽（L）,k 2，Vo 1000L,塔板数与流速的关系,塔板数 103,流速（cm/min）,K 容量因子：保留能力的量度,V0,V1,V2,V3,时间 0.5 1 2 5, 分离因子：峰分离程度的量度,1 根正相柱,柱串联,6 根柱串联叠加,柱串联是一个可以显著提高分辨率的有效工具，是一个分离复杂样品的简单技术，无需对硬件或溶剂作很大改变。每增加一个柱就可以提高分辩率，可增加柱直到达到需要的分离效果。,3根4克柱串联,一根12克柱,上海利穗,公司简介,全自动快速柱层

19、析系统,Dr Flash,Ez Purifier,全自动快速柱层析系统,Dr Flash ：双泵系统，大收集台面,EZ Purifizer ：单泵系统，利用电磁阀实现梯度运行,涉及领域，主要两大领域：,1、天然药物提取 2、合成化合物分离,客户对象：1、高校 2、科研单位 3、CRO公司（外包公司） 4、有研究室的医药公司,注：CRO即合同研究组织，Contract Research Organization,快速层析系统优点:,快速制备层析系统适用于:化学合成/天然产物/生物组分的分离提纯,亲水性化合物的分离提纯 高极性天然产物分离提纯 大分子的色谱分离(生物色谱,Biochromatogr

20、aphy ) 水溶性海洋天然产物分离提纯 中草药植物液体提取物(浸出液)的活性成分分离提纯 亲脂性化合物的分离提纯 手性分子的分离提纯,自动在线检测，灵活配置,最优的灵敏度和选择性 可使用性价比最佳的固定波长紫外检测器，在线检测用于纯净物的收集 可使用可变的多波长紫外检测器，一个波长的检测用于纯净物的收集，同时使用另外几个波长的检测器进行分离纯化的检测（最多可以使用6个波长） 可使用其他类型的在线检测器，如ELSD（蒸发光散色检测器）,标准品的分离,溶剂： 流动相A_石油醚； 流动相B_乙酸乙酯 分离物品： 苯乙酮、对羟基苯甲酸甲酯、 4-氨基苯甲酸,仪器运行参数,Method 设定界面,标准

21、样测试谱图,Peak Acetophenone 苯乙酮 Peak Methyparaben 对羟基苯甲酸甲酯 Peak 4-aminobenzonic acid 4-氨基苯甲酸,皂苷类化合物制备图 仪器：EZ Purifier 中压制备系统； 色谱柱：3根12g制备柱串联，填料为ODS-AQ（30-50m） ； 流动相：A 0.1甲酸水溶液，B 乙腈，梯度洗脱。 监测波长：214nm； 收集波长：254nm； 流速：25ml/min。,Add : 上海市浦东新区孙环路312号 Tel : 021-50203068;021-50203069 Fax : 021-58575595 Email : Website : ,Thank you！,