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1、实验1-3 溶菌酶的提取分离及鉴定（酶活力、纯度及分子量测定）,1,实验内容,1. 溶菌酶的粗提取 2. 溶菌酶的分离纯化及酶活力、蛋白浓度测定 3. 溶菌酶纯度鉴定与分子量测定,2,背景知识,溶菌酶（lysozyme）：胞壁质酶（muramidase）或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶（N-acetylmuramide glycanohydrlase），是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。 生物学效应：主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。该酶活性可被一些金属离子Cu2+，Fe2+，Zn
2、2+以及N-乙酰葡萄糖胺所抑制，能被Mg2+，Ca2+、NaCl所激活,3,4,5,溶菌酶理化性质：相对分子质量14700 Da，由129个氨基酸残基构，pI:10.8，最适温度为50，最适pH为67左右。280nm的消光系数为13.0,6,背景知识： 酶的提取、分离纯化 初步纯化（rough fractionation） （提取）：把酶从生物组织或细胞中以溶解状态释放出来的过程，即将尽可能多的酶，尽量少的杂质从原料中引入溶液。 高度纯化（fine fractionation） （精纯化）：除去与产物性质相似的杂质。 纯化方案评价：酶活力、蛋白浓度、纯度,7,粗纯化（ 提取）目标： a. 将目
3、的酶最大限度地溶解出来。 b. 保持生物活性。 注意：温度升高，溶解度加大。但为防止酶失活， 一般采用低温下（010）操作。,提取原则 a. 相似相溶。 b. 远离等电点的pH值，溶解度增加。,8,离心分离 （一）基本原理 1. 离心力 Fc = m ac m r 2 m r （2 N/60）2 N为离心机每分钟转数 （r/min ）； Fc通常以相对离心力RCF（relative centrifugal force）表示，即离心力F的大小相当于地球引力（重力常数g）的多少倍。一般用g（或数字g）表示。,RCF = m r （2 N/60）2 /mg= 1.12 10-5 N2 r 此公式描述
4、了相对离心力与转速之间的关系 旋转半径用r平均代替 r平均=1/2（r大+r小）cm,9,通常： 低速离心以每分钟的转数表示，如：4000r/min。 高速离心（超速），常以相对离心力（RCF）表 示，如：65000g。 两者可换算或查测算图。,10,离心机的种类,11,离心的形式,角式及水平（外摆）式：水平式一般为低速。 角式由低速到超速均有。,12,角式离心机和离心头（转子）,角式离心头要配套，低温使用要预冷，操作注意稳、盖、旋紧。,13,离心管,材质：玻璃，塑料 强度：和离心速度相配 大小：和转子配套 高速超速管要加盖,14,离心机操作,平衡、定温、定速、定时。,15,实验一、 溶菌酶的
5、粗提取略,16,酶精纯化常用技术,膜分离技术 柱层析技术 蛋白质结晶,17,Principles of Operation for Chromatography Techniques,Gel Filtration,Ion Exchange,Hydrophobic Interaction,Affinity,Reversed Phase,实验二、溶菌酶的分离纯化及酶活力、蛋白浓度测定,目的： 1. 掌握离子交换层析原理及层析操作所需的必须原件。 2. 掌握层析柱填装方法及层析填料的保存 3. 掌握比色法测定溶菌酶的浓度与酶活,18,原理： 根据溶菌酶 pI 10.8，pH 8.0 PBS 中携带？
6、电，与阴/阳离子层析填料可结合，通过吸附后，提高pH或离子强度将溶菌酶与其他蛋白进行分离达到纯化目的。 溶菌酶对革兰氏阳性菌细胞壁的酶解作用导致细菌完整性破坏，OD600值会下降，通过单位时间内（每分钟）OD600值的下降评价酶活性。 溶菌酶的活力单位（U）：在室温，pH8.0的条件下，OD600每分钟降低0.001为1个活力单位。 280nm的消光系数为13.0，根据 A=ECL 可粗略测定溶菌酶浓度，用于酶比活的评价。,19,20,离子交换层析 （ion exchange chromatography，IEC）,21,2.离子交换填料： 离子交换剂由载体、电荷基团和反离子构成。,纤维素 琼
7、脂糖 葡聚糖 载体 电荷基团,OCH2COO-,Na+,反离子,1.原理:根据待分离物质带电性质不同的分离 纯化方法。,22,离子交换剂,-带有电荷基团的不溶性载体,-O-CH2CH2N-H,CH2CH3,CH2CH3,Cl-,载体,Diethylaminoethyl (DEAE),23,两种离子交换剂,阴离子交换剂： 常用二乙氨基乙基，二乙氨基乙基2-羟丙基 阳离子交换剂： 常用羧甲基 CM CH2COO 磺丙基 SP C3H6SO3,DEAE C2H4N+(C2H5)2H QAE C2H4N+(C2H5)2CH2CH(OH)CH3,24,化学原料合成 ： sephadex sepharos
8、e 载体 天然材料制成： cellulose 如：DEAE-Sepharose， CM-Sepharose,25,实验设计原理,利用不同的蛋白质分子在溶液中所带电荷不同，因而与离子交换剂有不同吸附力而分离。,pH8.0,pI 8.0 蛋白质带正电,pI 8.0 蛋白质带负电,溶菌酶pI:10.8,26,2. 阴离子交换剂分离蛋白质的过程,平衡,吸附,去吸附,分离结束,再生,+,低盐,高盐,利用不同盐浓度将不同蛋白质洗脱下來,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,27,3.
9、操作 平衡 上样 冲洗 洗脱 再生 1）上样：上样体积不十分严格。 2）洗脱: 增加溶液的离子强度 梯度洗脱法 （连续、不连续）改变溶液的pH值 3）再生：0.5-1mol/L NaCl溶液处理。 4.应用 制备纯化生物大分子,28,梯度洗脱方式,29,图4-39 梯度溶液的制备方法和洗脱曲线 （a）线性梯度；（b）凸形梯度；（c）凹形梯度；（d）编程梯度,30,层析柱的制备与层析操作 柱层析的设备: 层析柱、蠕动泵（恒流泵）、检测仪、部分收集器、梯度洗脱器。,31,层析设备,层析装置： 梯度混和器 蠕动泵 层析柱 监测仪 记录仪 收集器,32,记录仪,现代化层析设备AKTA,层析柱XK BP
10、G,实验2.1 层析柱的填装,1.观摩 2.实验步骤 1）测定酶浓度（S-2） C(mg/ml)=A280/13 2）若填料载量为20mg/ml，计算拟纯化100mg 蛋白需要的填料量和量取量。,34,3）装柱要点： a. 用纯水将乙醇保存液置换 b. 柱头及柱底适配器确保无气泡，可用注射器推注赶气泡，并确保连接管路密闭无泄漏。 c. 填料倾倒入柱管内前先加入少量水覆盖柱底 d. 柱拆卸后填料务必回收，并保存于20%乙醇中。,35,二、酶的活力单位及酶活测定： 1. 酶活单位：1961年国际生化协会酶学委员会统一规定，酶的国际单位（IU）规定为：在最适反应条件（温度25）下，每分钟内催化1微摩
11、尔（mol）底物转化为产物所需的酶量（或1分钟内转化底物生成1微摩尔产物的酶量）称为1标准单位。,37,2.酶的比活力： 每单位酶蛋白所含的活力单位数。 对固体酶：用活力单位/mg酶蛋白、或活力单位/mg酶蛋白氮来表示； 对液体酶：用活力单位/ml酶液来表示。 很明显，比活力越大，酶的活力越大。,分光光度法：产物与适当的化学试剂生成有色物质 或产物有紫外吸收的能力可采用此法。 测压法：产物中有气体，测气压增加量。 滴定法：产物中有酸生成，用碱滴定。 荧光法：产物中有荧光物质生成或产物与荧光试剂 反应生成荧光产物可用此法。 旋光法：产物中有旋光物质可采用此法。,除了以上方法外，还可根据产物的性质
12、采用其它方法。,3.具体测定方法,4. 回收率和纯化倍数 回收率 100,提纯后酶总活力,提纯前酶总活力,纯化倍数,每次比活力,第一次比活力,40,实验2.2溶菌酶的活性测定,实验材料： 1. 枯草芽孢杆菌悬液 2. S1，S2 3. PBS等 4. 分光光度计、比色皿、计时器、离心机等,41,实验步骤： 1. 取6ml 菌悬液，3500rpm*5min，弃上清，沉淀 6ml PBS重悬。 2. 测定OD600并记录（吸光度0.51.0，若读数过高可适当稀释） 3. 测定样品准备（酶液务必在仪器等条件准备好，临测定前加入）,42,实验步骤： 4. 酶活性测定，以管（PBS）为对照，每隔30s
13、测定2,3,4管的OD600并记录 5. 酶活力及比活性计算： U=(ODn-OD2)/0.001*T(min)*0.2 C(mg/ml)=A280/13 6. 纯化回收率及纯化倍数计算,回收率 100,US2*V2,US1*V1,纯化倍数,S2比活力,S1比活力,43,7. 完成下表,44,实验3溶菌酶的纯度鉴定与分子量测定,实验目的: 1、通过实验的学习与操作，在实验过程更好的理解SDS-聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）测定蛋白质纯度与分子量的原理与依据； 2、掌握电泳原理以及SDS-PAGE垂直板电泳分析蛋白质技术； 3、熟悉垂直板电泳操作原理和方法，凝胶染色与脱色方法，SDS-PAGE分子量
14、测定图谱的绘制与计算； 4、了解在电泳中分子量标准物的使用。,45,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulphate- polyacrylamide gel electrophoresis, SDS- PAGE）简称SDS PAGE。 用于蛋白纯度及蛋白质亚基相对分子量（relative molecular mass, Mr）测定。,1.原理,46,1.原理,SDS是一种阴离子去污剂，带有大量负电荷，与蛋白质结合后使蛋白质所带负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异。 SDS破坏蛋白质氢键、
15、疏水键，引起蛋白质构象改变，使蛋白质SDS复合物形状近似椭圆形，短轴相同（1.8nm），长轴与蛋白质分子量成正比。 因此，蛋白质SDS复合物(SDS-denatured protein)在凝胶中的迁移率不受蛋白质原有电荷和形状的影响，只与椭圆棒长度（蛋白质分子量）有关。,47,SDS-PAGE separates proteins by MW,48,蛋白质的迁移率与分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX MW：分子量；X：迁移率；k、b均为常数 将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据其相对迁移率即可在标准曲线上
16、求得分子量。,49,50,2. 分离效应 PAGE根据其有无浓缩效应，分为： 连续电泳（continuous electrophoresis） 采用相同孔径的凝胶和相同的缓冲系统 不连续电泳（discontinuous electrophoresis） 采用不同孔径的凝胶和不同缓冲体系 电荷效应 不连续PAGE 分子筛效应 浓缩效应,连续PAGE,不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳,凝胶由上、下两层凝胶组成，两层凝胶的孔径不同，上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。 浓缩效应：使样品在浓缩胶中被浓缩成一条窄带，然后再进入分离胶进行分离。 电荷效应 : 分离胶中，蛋白质表面净电荷不同，迁移率不同。
17、分子筛效应 ：大小和形状不同的样品分子通过一定孔径的分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。,52,2. 实验步骤：（SDS-PAGE） 1）母液配制 2）制胶准备: 玻璃板清洗、干燥 制胶架的准备：严格按说明书组装制胶架 注意：轻拿轻放文明操作，避免玻璃板破损制胶架松动及其他设施偏离工作要求。,53,2. 实验步骤：（SDS-PAGE） 3）制胶: 分离胶、浓缩胶：根据待分离样品的分子大小选择15%的分离胶，如表配制,54,55,3、按比例配好分离胶，用移液管快速加入，大约5 cm左右，之后加少许蒸馏水，静置30分钟。凝胶配制过程要迅速，催化剂TEMED要在注胶前再加入，否则凝结无法
18、注胶。注胶过程最好一次性完成，避免产生气泡。水封的目的是为了使分离胶上延平直，并排除气泡。凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。 4、倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干，按比例配好浓缩胶，连续平稳加入浓缩胶至离边缘5 mm处，迅速插入样梳，静置10分钟。样梳需一次平稳插入，梳口处不得有气泡，梳底需水平。 5、电泳液缓冲（*10）配制：30g Tris, 150g Gly, 10g SDS+800ml dH2O, 定容至1000ml,56,5、样品处理：取30ul样品（S1，S2），加入30ul 上样缓冲液，100水浴30min， 拔出样梳后，在上槽内加入缓冲液，使锯齿孔内的气泡全部排出，否
19、则会影响加样效果。 6、加样3个，空出第一个孔，从第二个开始按已编排好的顺序依次加入相应体积的样品和蛋白Marker。其中蛋清（S1）和Marker加样量为2 l，S1、S2、S3、和S4加样量为10 l。为了练习和比较上样量的影响，可以加20 l的S1S2作为对照。注射器不可过低，以防刺破胶体，也不可过高，在样下沉时会发生扩散。为避免边缘效应，最好选用中部的孔注样。,57,7、电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电压恒定在160 V，当进入分离胶后改为240 V，溴酚蓝距凝胶边缘约5 mm时，停止电泳。 8、凝胶板剥离与染色：电泳结束后，用专用工具撬开短玻璃板，从凝胶板上切下一角作为
20、加样标记，然后放在大培养皿内，加入染色液，42染色40 min左右。剥胶时要小心，保持胶完好无损，染色要充分。 9、脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰。 10、将凝胶照相并进行分子量分析、测定。,58,将凝胶至于薄板上（水润避免破损），并至于白色背景上，用直尺量取marker中各条带距离分离胶前沿的距离，以对应的分子量绘制分子量标准曲线： logMW=K-bX 以量取溶菌酶的迁移距离带入公式中计算分子量,59,电泳胶实例,思考题,1. 层析柱填装的注意事项 2. 分光光度法测定溶菌酶活力的原理是什么？注意事项有哪些？ 3. P140 1-4,60,实验报告格式及要求,内容完整 报告表头（包括时间、地点、同组人员） 【实验目的】全 【实验原理】全 【实验材料】操作者 【实验步骤】操作者 【实验结果】操作者 【分析讨论】操作者 【思考题】 全,61,