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1、土壤中的微生物分离纯化和土壤中的微生物分离纯化和 菌相分析菌相分析 土壤中的微生物分离纯化和土壤中的微生物分离纯化和土壤中的微生物分离纯化和土壤中的微生物分离纯化和 菌相分析菌相分析菌相分析菌相分析 一一、实验目的实验目的 掌握用平板分离法和划线分离法分离土掌握用平板分离法和划线分离法分离土 壤中的微生物壤中的微生物（好气性细菌好气性细菌、放线菌和放线菌和 一般真菌一般真菌）。）。 二二、实验原理实验原理 从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某 一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。 分离微生物时一般是根据该微生
2、物对营养分离微生物时一般是根据该微生物对营养、PH、 氧气等要求的不同氧气等要求的不同，供给它们适宜的生活条件供给它们适宜的生活条件， 或加入某种抑制剂造成只利于该菌生长或加入某种抑制剂造成只利于该菌生长，不利于不利于 其他菌种生长的环境其他菌种生长的环境，从而淘汰不需要的菌种从而淘汰不需要的菌种。 微生物分离纯化的方法主要有微生物分离纯化的方法主要有：平板划线分离法平板划线分离法 和稀释涂布平板法和稀释涂布平板法。后者除能有效分离纯化微生物后者除能有效分离纯化微生物 外外，还可用于测定样品中活菌数量还可用于测定样品中活菌数量。 三三、实验器材实验器材 1.1.土壤土壤 2.2.培养基培养基：
3、 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（营养琼脂营养琼脂）（）（5050g/mLg/mL制霉菌素制霉菌素 乙醇溶液乙醇溶液） 高氏一号琼脂培养基高氏一号琼脂培养基（1010滴滴100g/L100g/L石碳酸和石碳酸和5050g/mLg/mL制霉菌制霉菌 素乙醇溶液素乙醇溶液） 马铃薯葡萄糖琼脂马铃薯葡萄糖琼脂（PDAPDA）（）（1000mL1000mL培养基中加入培养基中加入2mL2mL氯霉素氯霉素） 3.3.溶液与试剂溶液与试剂： 9mL9mL或或4.5mL4.5mL无菌水的试管无菌水的试管，90mL90mL无菌水并带有玻璃珠的三角无菌水并带有玻璃珠的三角 烧瓶烧瓶 四四、操作步骤
4、操作步骤 1.1.倒平板倒平板：将培养基加热溶化将培养基加热溶化，保温保温5555- - 6060，每个培养皿倒入每个培养皿倒入1515- -20mL20mL培养基培养基，静置静置 冷却固化冷却固化。 （一一）稀释涂布平板法稀释涂布平板法 倒平板的方法倒平板的方法： 右手持盛培养基的试管或三角烧瓶置火焰旁边右手持盛培养基的试管或三角烧瓶置火焰旁边， 用左手将试管塞或瓶塞轻轻的拔出用左手将试管塞或瓶塞轻轻的拔出，试管口或瓶口保试管口或瓶口保 持对着火焰持对着火焰；然后用右手手掌边缘或小指与无名指夹然后用右手手掌边缘或小指与无名指夹 住试管塞住试管塞。左手持培养皿并将皿盖在火焰旁打开一缝左手持培养
5、皿并将皿盖在火焰旁打开一缝， 迅速倒入培养基约迅速倒入培养基约15mL15mL，加盖后轻轻摇动培养皿加盖后轻轻摇动培养皿，使使 培养基均匀分布在底皿底部培养基均匀分布在底皿底部，然后平置于桌面上然后平置于桌面上，待待 凝后即为平板凝后即为平板。 倒平板倒平板 2.制备十倍梯度菌稀释液制备十倍梯度菌稀释液：用一支用一支1mL无菌无菌 吸管吸取吸管吸取0.5mL菌悬液加入菌悬液加入4.5mL无菌水的无菌水的 试管中充分混匀试管中充分混匀，此为此为10-1稀释液稀释液，以此类以此类 推制成推制成10-2、10-3、10-4、10-5和和10-6六种十倍六种十倍 梯度稀释的菌悬液梯度稀释的菌悬液。 从
6、土壤中分离微生物从土壤中分离微生物 的操作过程的操作过程 3.3.涂布涂布：将上述每种培养基的平板底部或培养将上述每种培养基的平板底部或培养 皿盖周边用记号笔分别写上皿盖周边用记号笔分别写上10-4、10-5和和10-6三种三种 稀释度字样稀释度字样，每种培养基每稀释度标记每种培养基每稀释度标记2 2皿皿，然后然后 用无菌吸管分别由用无菌吸管分别由10-4、10-5和和10-6 三三管菌悬液中吸管菌悬液中吸 取适量对号放入已写好稀释度的平板中央位置取适量对号放入已写好稀释度的平板中央位置， 每皿准确放入每皿准确放入0.2mL，用无菌玻璃涂布棒在培养基表用无菌玻璃涂布棒在培养基表 面轻轻涂布均匀
7、面轻轻涂布均匀，其方法是将菌液先沿一条直线轻轻其方法是将菌液先沿一条直线轻轻 的来回推动的来回推动，使之分布均匀使之分布均匀，然后改变方向然后改变方向90沿另沿另 一垂直线来回推动一垂直线来回推动，平板内边缘处可改变方向用涂布平板内边缘处可改变方向用涂布 棒在涂布几次棒在涂布几次，室温下静置室温下静置5-10min。 4.4.培养培养：将平板倒置于将平板倒置于3737温室中培温室中培 养养1 1- -2d2d。 5.5.挑菌落挑菌落：将培养后长出的单个菌落分别挑取少许将培养后长出的单个菌落分别挑取少许 菌苔接种在不同培养基的斜面上菌苔接种在不同培养基的斜面上，置置37/28 培培 养养；待菌苔
8、长出后待菌苔长出后，检查其特征是否一致检查其特征是否一致，同时将同时将 细胞图片染色后用显微镜检查是否为单一的微生物细胞图片染色后用显微镜检查是否为单一的微生物 细胞细胞。若发现有杂菌若发现有杂菌，须再进行一次分离与纯化直须再进行一次分离与纯化直 到获得纯培养到获得纯培养。 1.1.倒平板倒平板 2.2.划线划线：在近火焰处在近火焰处，左手拿皿底左手拿皿底，右手拿接种环右手拿接种环， 挑取待测菌悬液一环在平板上划线挑取待测菌悬液一环在平板上划线。划线的方法很划线的方法很 多多，但无论采用哪种方法但无论采用哪种方法，其目的都是通过划线将其目的都是通过划线将 样品在平板上进行稀释样品在平板上进行稀
9、释，培养后能形成单个菌落培养后能形成单个菌落。 （二二）平板划线分离法平板划线分离法 划线方法划线方法 方法一方法一：用接种环按无菌操作挑取土壤悬液一环用接种环按无菌操作挑取土壤悬液一环， 先在平板培养基的一边作第一次平行线先在平板培养基的一边作第一次平行线3 3- -4 4次次，再再 转动平板约转动平板约7070角角，并将接种环上剩余物烧掉并将接种环上剩余物烧掉，待冷待冷 却后挑取悬液穿过第一次划线部分进行第二次划线却后挑取悬液穿过第一次划线部分进行第二次划线， 再用同样的方法穿过第二次划线部分进行第三次划线再用同样的方法穿过第二次划线部分进行第三次划线 或再穿过第三次划线部分进行第四次划线
10、或再穿过第三次划线部分进行第四次划线。划线完毕划线完毕 后后，盖上培养皿盖盖上培养皿盖，倒置于温室培养倒置于温室培养。 方法二方法二：将挑取有样品的接种环在平板培养基上作连将挑取有样品的接种环在平板培养基上作连 续划线续划线，完毕后完毕后，盖上培养皿盖盖上培养皿盖，温室培温室培 养养。 平板划线操作图平板划线操作图A A 分段划线分段划线B B 连续划线连续划线 3.3.挑菌落挑菌落：从分离的平板上单个菌落挑取从分离的平板上单个菌落挑取 少许菌苔于不同培养基斜面上少许菌苔于不同培养基斜面上，做锯齿状划做锯齿状划 线线，3737培养后培养后，涂在载玻片上涂在载玻片上，在显微镜在显微镜 下观下观
11、察细胞的个体形态察细胞的个体形态，结合菌落形态特结合菌落形态特 征征，综合分析综合分析。如不纯如不纯，仍需平板分离法进仍需平板分离法进 行纯化行纯化，直至确认为纯化培养为止直至确认为纯化培养为止。 一一、实验原理实验原理 平板菌落计数法平板菌落计数法（活菌计数活菌计数）是根据微生物在固是根据微生物在固 体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖 而成的现象进行的而成的现象进行的，也就是说一个菌落即代表一个也就是说一个菌落即代表一个 单细胞单细胞。计数时计数时，先将待测样品作一系列稀释先将待测样品作一系列稀释，再再 取一定量的稀释菌液接种到培养皿中取
12、一定量的稀释菌液接种到培养皿中，使其均匀分使其均匀分 布于平皿中的培养基内布于平皿中的培养基内，经培养后经培养后，由单个细胞生由单个细胞生 长繁殖形成菌落长繁殖形成菌落，统计菌落数目统计菌落数目，即可换算出样品即可换算出样品 中的含菌数中的含菌数。 活菌计数活菌计数 这种计数法的优点是能测出样品中的活菌数这种计数法的优点是能测出样品中的活菌数。 但平板菌落计数法的手续较繁但平板菌落计数法的手续较繁，而且测定值常受各而且测定值常受各 种因素的影响种因素的影响。 二二、实验步骤实验步骤（方法一方法一） 1.1.编号编号：取无菌培养皿取无菌培养皿6 6套套，分别用记号笔表明分别用记号笔表明 10-4
13、、10-5、10-6各各2 2套套。另取另取6 6支支4.5mL4.5mL无菌水无菌水 的试管的试管，依次表明依次表明10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和和10-6。 2.2.稀释稀释：用用1mL无菌吸管准确吸取无菌吸管准确吸取0.5mL已充分混匀已充分混匀 的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的混合培养液的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的混合培养液，加入标加入标 有有10-1字样的试管中字样的试管中，此为此为10倍稀释倍稀释，吸管中多余的菌吸管中多余的菌 液放回试管中液放回试管中。将将1010- -1 1试管在手掌中或置于振荡器上振试管在手掌中或置于振荡器上振 荡荡，使菌液充分混匀使菌液充分混
14、匀。另取一支另取一支1mL吸管插入吸管插入10-1试管试管 菌液中吸取菌液中吸取1mL，精确的放精确的放0.5mL菌液于菌液于10-2试管中试管中， 此为此为100倍稀释倍稀释其余依次类推直至所需倍其余依次类推直至所需倍 数数。 3.3.倒平板倒平板：倒入熔化后冷却至倒入熔化后冷却至4545左右的牛肉左右的牛肉 膏蛋白胨琼脂培养基约膏蛋白胨琼脂培养基约15mL15mL于平皿中于平皿中，置水平置水平 为止为止，迅速旋动平皿迅速旋动平皿，待培养基凝固后备用并待培养基凝固后备用并 标号标号。 4.4.取样取样：用用3 3支支1mL1mL的无菌吸管分别吸取的无菌吸管分别吸取1010- -4 4、101
15、0- -5 5和和 1010- -6 6稀释菌悬液各稀释菌悬液各0.2mL0.2mL，放入已标号的平板中放入已标号的平板中，涂涂 布布。静置半小时后静置半小时后，将平板倒置于将平板倒置于3737恒温培养箱恒温培养箱 中培养后计数中培养后计数。 5.5.计数计数：培养培养48h48h后取出培养平板后取出培养平板，根据统计的根据统计的 菌落数菌落数，计算出同一稀释度计算出同一稀释度2 2个平板上的菌落平个平板上的菌落平 均数均数，按下列公式进行计算按下列公式进行计算： 每毫升样品中菌落形成单位每毫升样品中菌落形成单位（CFU/mL） = =同一稀释度同一稀释度2 2次重复的平均菌落数次重复的平均菌
16、落数稀稀 释倍数释倍数5 活菌计数流程图活菌计数流程图 细菌细菌 放线菌放线菌 霉菌 霉菌霉菌 酵母酵母 实验方法二实验方法二 1. 编号编号：取无菌培养皿取无菌培养皿6 6套套，分别用记号笔表明分别用记号笔表明 10-4、10-5、10-6各各2 2套套。另取另取6 6支支4.5mL4.5mL无菌水无菌水 的试管的试管，依次表明依次表明10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和和10-6。 2.2.稀释稀释：用用1mL无菌吸管准确吸取无菌吸管准确吸取0.5mL已充分混匀已充分混匀 的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的混合培养液的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的混合培养液，加入标加入标 有有10-1
17、字样的试管中字样的试管中，此为此为10倍稀释倍稀释，吸管中多余的菌吸管中多余的菌 液放回试管中液放回试管中。将将1010- -1 1试管在手掌中或置于振荡器上试管在手掌中或置于振荡器上 振荡振荡，使菌液充分混匀使菌液充分混匀。另取一支另取一支1mL吸管插入吸管插入10-1试试 管菌液中吸取管菌液中吸取1mL，精确的放精确的放0.5mL菌液于菌液于10-2试管试管 中中，此为此为100倍稀释倍稀释其余依次类推直至所需倍数其余依次类推直至所需倍数。 3.3.用用3 3支支1mL1mL的无菌吸管分别吸取的无菌吸管分别吸取1010- -4 4、1010- -5 5和和1010- -6 6 稀释菌悬液各
18、稀释菌悬液各0.2mL0.2mL，放入已灭菌的平板中放入已灭菌的平板中，然后然后 倒入冷却至倒入冷却至4545左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基约左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基约 15mL15mL，迅速旋动平皿迅速旋动平皿，混匀培养基和菌稀释液混匀培养基和菌稀释液，后静后静 置凝固置凝固，倒置于倒置于3737恒温培养箱中培养后计数恒温培养箱中培养后计数。 4.4.计数计数：培养培养48h48h后取出培养平板后取出培养平板，根据统计的菌落根据统计的菌落 数数，计算出同一稀释度计算出同一稀释度2 2个平板上的菌落平均数个平板上的菌落平均数，按按 下列公式进行计算下列公式进行计算： 每毫升样品中菌落形成单位每毫升样品中菌落形成单位（CFU/mL） = =同一稀释度同一稀释度2 2次重复的平均菌落数次重复的平均菌落数稀释倍数稀释倍数5 实验报告实验报告 1描述分离纯化的各种微生物菌落的特性描述分离纯化的各种微生物菌落的特性。 2将培养后菌落计数结果填入下表将培养后菌落计数结果填入下表： 每毫升样品中菌落形成单位每毫升样品中菌落形成单位（CFU/mL） = =同一稀释度同一稀释度2次重复的平均菌落数次重复的平均菌落数稀释倍数稀释倍数5 菌落数菌落数 平均平均21平均平均21平均平均21次数次数 CFU/mL10-610-510-4稀释度稀释度