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1、.枯草杆菌1和枯草杆菌2的原生质体融合育种一、 细菌原生质体融合育种总述：原生质体融合是20世纪70年代发展起来的基因重组技术。用水解酶除去遗传物质转移的最大障碍细胞壁，制成由原生质膜包被的裸细胞，然后用物理、化学或生物学方法，诱导遗传特性不同的两亲本原生质体融合，经染色体交换、重组而达到杂交的目的，经筛选获得集双亲优良性状于一体的稳定融合子。近年来，该技术已成为生物界颇受瞩目的研究领域，是细胞生物学中迅速发展的方向之一。Fodor和Schaeffer于1976年分别报道了巨大芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌种内原生质体融合，微生物原生质体融合现象得到证实，并建立了相应的实验体系。从此，原生质体融合育种
2、广泛应用于霉菌、酵母菌、放线菌和细菌，并从株内、株间发展到种内、种间，打破种属间亲缘关系，实现跨界融合。枯草芽孢杆菌是革兰氏阳性菌，革兰氏阳性菌细胞壁组成是肽聚糖、磷壁酸和一些多糖蛋白质。肽聚糖的骨架由N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸通过-1,4糖苷键交替连接而成。溶菌酶和青霉素对细菌细胞壁都有一定的降解作用，溶菌酶是作用于细菌细胞壁肽聚糖主链的-1,4糖苷键上；而青霉素的作用机制是竞争性地与转肽酶结合，阻碍了侧链的交联，作用在代谢时发生，因此必须在细菌生长分裂时期才有效。细菌原生质体融合育种程序一般是：1、 菌株选择和遗传标记2、 原生质体制备和再生3、 原生质体融合4、 融合体再生与检出5
3、、 重组子分离和遗传分析二、 枯草芽孢杆菌融合育种的重要意义枯草芽孢杆菌是一种常见的有益菌，它可以净化水质，分解许多种有机质，通过融合育种可以将枯草芽孢杆菌1、2两个亲本的优良性状集中体现在融合细胞中，具有重要的遗传学意义。精品.通过筛选成功融合并能稳定遗传的工程菌投入生产，将产生巨大的经济效益和社会效益。三、枯草芽孢杆菌原生质体融合育种具体步骤 （一） 培养基和溶液1、常用培养基（1）CM培养基（%）：牛肉膏0.5，蛋白胨1，葡萄糖0.5，酵母膏0.5，NaCl 0.5,pH 7.2。(2) DM3培养基：1mol/L琥珀酸钠500ml, 5%水解酪蛋白100ml， 10%酵母膏50ml，3
4、.5% K2HPO4和1.5% KH2PO4100ml, 20%葡萄糖25ml，1mol/LMgSO420ml，2%牛血清蛋白5ml，4%琼脂200ml。（3完全再生培养基：CM培养基中加入高渗溶液。2、高渗溶液DF溶液（mol/L）：蔗糖0.25，琥珀酸钠0.25，EDTA 0.001，K2HPO4 0.02，KH2PO4 0.11，MgCl26H2O 0.01，pH 7.0。SSM溶液(mol/L): 蔗糖0.5，顺丁烯二酸0.02，MgCl26H2O 0.02，pH 6.5。HM溶液（%）：NH4Cl 0.1, Tris 1.2, KCl 0.0035, NaCl 0.0058, Na2
5、SO410H2O 0.03, MgCl25H2O 0.01, pH7.0。（二）枯草芽孢杆菌原生质体的制备1、培养枯草芽孢杆菌 取亲本菌株枯草芽孢杆菌1、2新鲜斜面分别接一环到装有液体完全培养基(CM)的试管中，36振荡培养14 h，各取1 mL 菌液转接入装有20 mL 液体完全培养基的250 mL 锥形瓶中，36振荡培养 3 h，使细胞生长进入对数前期，各加入25 u/mL 青霉素，使其终浓度为0.3 u/mL，继续振荡培养2 h。 2、收集细胞 各取菌液10 mL，4000 r/min 离心10 min，弃上清液，将菌体悬浮于磷酸缓冲液中，离心。如此洗涤两次，将菌体悬浮10 mL SMM
6、 中，每mL 约含108109 活菌为宜。 3、总菌数测定 精品. 各取菌液0.5 mL，用生理盐水稀释，取10-5、10-6、10-7 各1mL(每稀释度作两个平板)、倾注完全培养基，36培养24 h 后计数。此为未经酶处理的总菌数。 4、脱壁 两株亲本菌株各取5 mL 菌悬液，加入5 mL 溶菌酶溶液，溶菌酶浓度为100 ug/mL，混匀后于36水浴保温处理30 min，定时取样，镜检观察原生质体形成情况，当95%以上细胞变成球状原生质体时，用4000 r/min 离心10 min，弃上清液，用高渗缓冲液洗涤除酶，然后将原生质体悬浮于5 mL 高渗缓冲液中。立即进行剩余菌数的测定。 5、剩
7、余菌数测定 取0.5 mL 上述原生质体悬液，用无菌水稀释，使原生质体裂解死亡，取10-2、10-3、10-4 稀释液各0.1 mL，涂布于完全培养基平板上，36培养2448 h，生长出的菌落应是未被酶裂解的剩余细胞。 计算酶处理后剩余细胞数，并分别计算二亲株的原生质体形成率。原生质体形成率未经酶处理的总菌数一酶处理后剩余细胞数。（3） 枯草芽孢杆菌原生质体再生上述原生质体悬浮液适当稀释后，取0.1ml接种于DM3再生培养基上，迅速加入0.8%琼脂的相同成分培养基4ml，轻轻摇匀，双层平板30培养34d，计算再生菌落数，为原生质体和少量未酶解细胞数之和;原生质体悬液用无菌水破坏原生质体后也涂布
8、、培养，生长出的菌落，为未酶解的细菌细胞。并可计算制备率和再生率。（4） 枯草芽孢杆菌原生质体融合原生质体融合方法是取等量的两种不同菌株的原生质体悬浮液，加入新制备或在HM中保存的原生质体溶液混匀，4000r/min离心10min，沉淀物转入新鲜的HM原生质体保存溶液中，加入40%聚乙二醇4000,40下静置13min。然后加入10倍左右的HM液，离心弃上清，用再生培养基适当稀释，分别接种在完全再生培养基和选择性基本培养基上培养、再生。基本培养基上生长的菌落可初步判定为融合子。同时另取单一亲本及不加PEG的双亲本原生质体混合液分别作为对照，以计算融合率。精品.（5） 融合体的再生和检出融合原生
9、质体与非融合原生质体一样对外界条件异常敏感，必须悬浮于一定的高渗溶液中。再生培养基要加入某些物质作为渗透压的稳定剂，这与制备原生质体时是相同的。再生培养基可以采用添加Ca2+、Mg2+ 的完全培养基，或者是高渗基本培养基。含有融合原生质体的悬浮液分离在完全培养基上，不管已融合的还是非融合的原生质体都有可能再生而长出菌落。在基本培养基上则只有那些营养得到互补的融合体才能得到再生而长出菌落，但营养贫乏，再生速度慢，频率低。枯草杆菌融合体再生方法与原生质体再生方法相同，即使用DM3再生培养基双层平板培养。融合体的检出方法有很多，如利用营养缺陷型标记选择、利用抗药性选择、用灭活原生质体检出融合体、利用
10、荧光染色法选择等等。在本实验中，因不知枯草杆菌1、2亲本有无营养缺陷和抗药基因且如果添加营养缺陷型标记或抗药标记可能会使亲本优良性状丧失或降低，故我们采用荧光染色法选择融合体。荧光染色法是事先使双亲染色而携带不同荧光色素标记，然后在显微操作器和荧光显微镜下，挑选同时带有双亲原生质体荧光标记的融合体，直接分离到再生培养基上再生，最后得到融合体。常见的荧光染色剂有EGFP（增强绿色荧光蛋白）、CFSE(即CFDA-SE，羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯)、Calcein-AM（钙黄绿素-AM）等。具体方法是：制备原生质体时在酶解液中加入荧光色素，使双亲原生质体分别携带不同的荧光色素标记。它对原生质体
11、活力无影响，携带色素的原生质体能正常进行融合并具有再生能力。融合处理时在荧光显微镜下能观察到融合过程并通过显微操作仪，直接挑选出已发生融合而带有两种荧光色素的融合体。使用这种方法时，要注意染料的浓度和处理时间，同时染料不能对原生质体形成、再生有影响，用于双亲染色的荧光物质颜色分辨要明显，色素有效处理时间不能超过24小时。（六）重组子分离与遗传分析精品.具有两种优良性状的亲本枯草杆菌融合后，融合子将集两种性状于一身，所以重组子分离我们可以将融合产物直接分离在基本培养基上或选择性培养基平板上，期中融合体由于营养互补或具有双重抗药性等等，经过再生，长出的菌落为融合菌落，同时还涂布于完全培养基上，以作对照，则可直接检出融合细胞。最后在基本培养基上检出原养型的融合重组子，注意进行两亲株互养试验，以排除因交叉互养或转化而形成原养型菌落的可能。为了确证所筛选的重组体，还需要对其进行传代稳定性试验和进一步鉴定。主要包括形态学、生理生化特性和遗传特性研究，如菌落颜色与形态、细胞电镜比较、DNA含量、代谢产物产量以及同工酶谱测定等。四、参考文献与网站施巧琴,吴松刚.工业微生物育种学.第二版.北京:科学出版社,2003,296329.岑沛霖,蔡谨.工业微生物学.第二版.北京:化学工业出版社,2008,240243.http:/