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1、.金黄色葡萄球菌在小鼠体内染色性的恢复【摘要】目的：研究经多次传代培养染色性转阴的金黄色葡萄球菌在小鼠体内革兰染色阳性的恢复，探讨其染色性状的改变与耐药性的关系。方法：对药物敏感性金黄色葡萄球菌（金敏）和耐药金黄色葡萄球菌（金耐）进行传代培养，将培养成革兰染色阴性的金敏和金耐注射至小鼠腹腔，数天后收集小鼠腹腔液，进行培养，通过革兰染色观察金黄色葡萄球菌的染色性质，并分析其染色性质变化与耐药性的关系。 结果：金敏第35代、金耐第37代革兰染色性状部分变为阴性，菌体特征无明显改变；金敏第37代、金耐第40代的革兰氏染色性状完全变为阴性，菌体大部分呈圆形，部分可见卵圆形及巨型体。革兰染色阴性的金敏和
2、金耐经小鼠体内培养染色性恢复为阳性。 结论：多次传代培养后革兰染色性质转阴的金黄色葡萄球菌经小鼠体内培养可以恢复为染色阳性。【关键词】金黄色葡萄球菌，染色性恢复，革兰染色，耐药性Recovery of Gram stain of Staphylococcus aureus in miceAbstractObjective: To investigate the alterations of gram staining results after repeated passages , the changes after the altered Staphylococcus aureus wer
3、e transplanted into the mice and discuss the relationship between the dyeing recovery and drug resistance. Methods: The Staphylococcus aureus susceptive to drugs and those resistant to drugs had been continuously cultured until the their gram staining results changed respectively. These changed bact
4、erium would be then transplanted into mice through intraperitoneal injection. Peritoneal fluid would be collected after a few days to observe the staining properties of Staphylococcus aureus, and to analyze the relationship between the altered results of gram staining and drug resistance.精品.Results:
5、 Gram staining results began to change when Staphylococcus aureus with drug susceptibility was cultured to the 35th generation and those with drug resistance to the 37th .And the results has completely changed when Staphylococcus aureus with drug susceptibility was cultured to the 37th generation an
6、d those with drug resistance to the 40th with significant morphologically changes. The results can be reversed by transplanting the bacterium into mice through intraperitoneal injection.Conclusion: The Staphylococcus aureus with altered gram staining result after repetitive passages can can revert t
7、o the positive staining after transplanted into mice through intraperitoneal injection.Key words Staphylococcus aureus, dyeing recovery, Gram stain, drug resistance 金黄色葡萄球菌（）广泛分布于自然界中，是引起机体化脓性感染最常见的病原菌，能引起医院或社区获得性感染,引起人畜多种疾病。典型的金黄色葡萄球菌为球型，显微镜下排列成葡萄串状，革兰染色阳性。有人观察到，金黄色葡萄球菌16h后有一部分菌体呈革兰氏阴性被染成红色【1】。研究表明
8、多种细菌在某些理化因素作用下可以转变为L型，由于细菌细胞壁缺损，与原菌比较细菌L型形态、染色性质、培养特性、生化反应、耐药性等生物学性状发生改变【2】，L型金黄色葡萄球菌呈革兰染色阴性。自1961年英国首次发现耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)以来，金黄色葡萄球菌的耐药率和MRSA的检出率越来越高，成为院内感染极为棘手的问题【3】。它对青霉素、红霉素、庆大霉素等耐药率高，同时携带多种耐药基因【4】。另外，随着万古霉素的广泛应用，耐万古霉素金黄色葡萄球菌和万古霉素中介金黄色萄球菌已出现【5】。金黄色葡萄球菌的耐药性的逐渐增强，对临床用药的选择带来了诸多问题。近年来，对于金黄色葡萄球菌的耐药性研
9、究越来越广泛，逐渐揭示了其产生耐药性的机制。研究显示，MecA基因的表达水平可能与MRSA对-内酰胺类抗生素耐药程度相关【6】。MRSA中MecA基因在金黄色葡萄球菌的耐药中发挥重要作用【7】。而脂质体包裹的抗mecA的PS-ODN010能够选择性抑制MRSA的mecA表达，有效逆转MRSA对内酰胺类抗生素的耐药性【8】。另一方面，已有的研究表明一些基因表达产物如松鼠葡萄球菌的mecA基因产物能够利用金黄色葡萄精品.球菌的细胞壁前体合成金黄色葡萄球菌的细胞壁【9】。因此猜想金黄色葡萄球菌的耐药性可能与细胞壁的合成或增生有关，革兰染色阴性的金黄色葡萄球菌可能与细菌耐药性有一定的相关性。研究表明细
10、菌在复杂的宿主环境下的基因表达调控与体外系统有较大差别，金葡菌革兰染色形状的改变可能与其细胞壁的丢失相关。我们猜想是否可以通过将在传代过程中革兰氏染色呈阴性的金黄色葡萄球菌通过注入到小鼠体内，改变其基因表达的环境，将金黄色葡萄球菌革兰氏染色转为阳性。通过金黄色葡萄球菌染色性的恢复，可以提高实验室培养金黄色葡萄球菌的效率。也可为进一步探索金黄色葡萄球菌的耐药机制打下基础，为治愈或减轻因其而感染的动物或因沾染食物而感染的患者具有一定的积极意义。葡萄球菌是革兰阳性球菌中的一种,广泛分布于自然界,如空气、水、土壤、饲料和一些物品上,也存在于人、动物的体表、鼻咽部及肠道,绝大多数对人不致病,少数可引起人
11、或动物致病,属于人兽共患病原菌。其中金葡菌致病力最强,也最重要。金黄色葡萄球菌在环境中无处不在,能引起医院或社区获得感染,是一种非常重要的条件致病菌。金黄色葡萄球菌的感染能引起人畜多种疾病,从比较常见的皮肤的浅表感染如丘疹、脓包、疥疮、烫伤样皮肤综合症,到可以致死的深层感染如肺炎、脑膜炎、骨髓炎、心内膜炎、中毒性休克综合症以及败血症等【10-11】。典型的金黄色葡萄球菌为球型,直径0.8Lm左右,显微镜下排列成葡萄串状。金黄色葡萄球菌无芽胞、鞭毛,大多数无荚膜。革兰染色阳性,经过多次传代培养后可有部分转为阴性。精品. 由于金黄色葡萄球菌肠毒素引起的中毒暴发事件,许多国家设有专门机构研究,对付金
12、黄色葡萄球菌引起的医院感染。随着-内酰胺类抗生素在临床的广泛应用,引起医院感染的多重耐药菌-耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)在临床分离的葡萄球菌中比例不断增加【12-14】,由于MRSA不仅对甲氧西林和其他-内酰胺类抗生素耐药,而且还常对氨基糖苷类、红霉素等耐药,因此了解其耐药机制及对其准确、及时的检出,对于感染的早期快速诊断,指导临床用药及防止医院内感染流行和耐药菌的播散都是极为重要的。而更加严重的是在近几年来已经发现对MRSA唯一有效的治疗药物-万古霉素耐受的金黄色葡萄球菌,而金黄色葡萄球菌一旦对万古霉素耐药,临床将面临无药可供选择的局面。现在有研究表明随着万古霉素诱导浓度的增加，金葡
13、菌对万古霉素的MIC逐渐增加；菌谱分析显示耐药亚群逐渐增加；电镜摄片可见细胞壁增厚，细胞壁粗糙，有结节状凸起；von基因检测为阴性【15】。因此我们可以得出结论：在万古霉素的选择性压力下金葡菌的耐药性可逐渐增加，细胞壁增厚是金葡菌对万古霉索耐药的重要机制。因此我们可以传代选出革兰氏呈阴性的金葡菌，即无细胞壁的金葡菌来研究金葡菌对万古霉菌的耐药性，同时还可以测定金葡菌细胞壁的有无对金葡菌对万古霉素的耐药性的影响。 本次研究对金黄色葡萄球菌（金敏和金耐）分别进行体外连续传代培养，发现金敏传37代、金耐传40代时发生细菌染色性的改变，即由革兰阳性变为革兰阴性。然后将已经发生细菌染色性改变的金葡菌（金
14、敏和金耐）通过腹腔注射入小鼠体内，经过4天的自然培养，处死小鼠后，取出小鼠的腹腔液进行细菌培养并进行革兰氏染色。染色结果提示发生细菌染色性改变的金葡菌（金敏和金耐）通过小鼠体内培养后染色性恢复。精品. 细菌L型(bacterial L-forms)即细菌细胞壁缺陷型(cell walldeficient bacteria，CWDB)，是Klieneberger于1935年在Lister研究所工作时发现，因而以其第一个字母L命名。目前由于某些作用于细胞壁抗生素的广泛使用及诸多因素的影响，导致细菌变异为L型，因此人工亦能成功诱导L型细菌【16】。细菌L型是细菌细胞壁部分或完全缺失后形成的原生质体,
15、其生长条件和药物敏感性都与原菌有较大不同,在临床上不易诊断,常漏诊误诊。许多细菌都可形成L-型,其感染与临床的许多慢性疾病有关,诊断和治疗相对困难。以往的试验大多采取抗生素诱导的方式获得L型细菌，而本次试验通过体外多次传代的方式获得L型金黄色葡萄球菌则模拟了金黄色葡萄球菌在自然环境下增殖情况，并且从33代开始对每代金葡菌进行革兰氏染色，观察其革兰染色性状的改变程度。因此，通过对本次试验获得的格兰染色阴性金葡菌进行药敏试验或耐药性分析可能对金葡菌L型的毒性、耐药性研究有所帮助，从而为临床对金葡菌L型的用药选择提供参考。金黄色葡萄球菌的细胞壁的主要成分为黏肽，占胞壁干重的5080。有文献报道【17
16、】，当细菌的细胞壁缺失时，细菌的形态也常发生变化，除菌种不同而形态各异外，可见杆状、圆形、卵圆形、巨型体、小球体及长丝状等；对L型细菌进行革兰染色时可发现，有的革兰阳性细菌变成阴性菌，或在同一张涂片上同时可见到革兰阳性菌和革兰性菌。本试验中，经多次传代的金敏传35代，金耐传37代时经革兰染色后，在同一张涂片上，同时可见到革兰阳性球菌和革兰染色呈阴性的细菌，菌体基本无明显改变。但金敏传37代，金耐传40代时金葡菌的革兰氏染色性状完全改变，菌体大部分呈圆形，部分可见卵圆形及巨型体，与文献报道基本一致。因此，我们推断改变染色性的金葡菌应该为L型金葡菌，因为L型金葡菌不稳定且药敏性与初代金葡菌相比有较
17、大的改变，我们将变性的金葡菌通过腹腔注射注入小鼠体内自然培养，取出小鼠的腹腔液进行细菌培养并进行革兰氏染色精品.，发现金葡菌（金敏和金耐)染色性得到了恢复。 这种改变的机制尚未明确。首先，有研究表明L型金葡菌的形成可能是由于生长环境的改变，基因突变，FtsZ依赖性的细胞分化和细胞返祖现象【18-19】。目前有一种利用枯草杆菌形成的可追踪系统【20】研究L型细菌的生物学和基因学特性并且用该系统来寻找L型生长【21】，研究发现在L型增殖过程中没有发现细胞骨架蛋白的参与,但是一种特殊的支链脂肪酸的断裂在子细胞的分离中起重要作用,提示膜的生物物理特性在L型增殖中起关键作用.即L型增殖是由于支链脂肪酸合
18、成过度而生成过多的薄膜而导致的【22】。细胞的L型变也可以看作是一种返祖现象，并且可以作为原始简单细胞的模型【23-24】。有研究表明葡萄球菌中普遍存在生物被膜生长能力，其中40%以上带有强或中等被膜形成能力；由于食源性微生物形成生物被膜后，具有逃逸常规消毒和杀菌手段的能力，同时更易于形成毒素，由此成为食品安全中的潜在隐患【25】。因此生物被膜的形成可能会增加金黄色葡萄球菌的耐药性以及毒性。ica操纵子为金黄色葡萄球菌生物被膜形成所必须，ica操纵子可能通过介导gbaAB操纵子参与金黄色葡萄球菌多细胞聚集阶段的受葡萄糖诱导的生物被膜形成【26】。生物膜的形成过程分为两个阶段：粘附阶段和聚集阶段
19、。而生物被膜的聚集及成熟阶段，主要是依靠促进细菌相互聚集的多糖黏附素，特别是多糖胞间黏附素(polysaccharide intercellularadhesion,PIA)发挥重要作用，PIA是细菌在生物膜形成过程中至关重要的物质，由ica 操纵子表达的酶进行生物合成【27】。金黄色葡萄球菌生物被膜的形成是一个复杂的多基因调控的结果，agr精品.基因、细菌黏附聚集相关蛋白如聚集相关蛋白(accumulation associated protein,aap基因编码)、自溶E( autolysin E,atlE 基因编码)等也参与了生物膜的形成【28-30】。通过对本次试验小鼠腹腔中提取的复性
20、金葡菌的生物被膜的基因型进行研究与分析，有助于在分子水平上深入阐述食源性细菌形成生物被膜的总体力，包括其粘附、被膜成熟与脱落，以及被膜表面构架蛋白与基质多糖生成的菌体特性等，并可通过对本次试验中革兰阴性和复性为革兰阳性的金葡菌生物被膜基因型的研究分析来探讨金葡菌染色性的变化与其毒性以及耐药性可能存在的关系。同时，金黄色葡萄球菌是医院内、外感染最常见的病原体之一,其所致感染病死率高、耐药严重,给治疗带来了极大困难。疫苗是预防金黄色葡萄球菌感染的有效手段,现研究的疫苗主要分为四大类:以金黄色葡萄球菌全菌或部分菌体为疫苗,针对荚膜和黏附因子的疫苗、针对毒素和酶的疫苗和针对毒力因子表达调控蛋白的疫苗【
21、14，31-32】。金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)疫苗是预防金黄色葡萄球菌感染的有效手段,可缓解抗生素应用所致的选择性压力,大大延缓耐药菌的产生,且与抗生素有协同作用,有望解决金葡菌感染这一棘手问题。我们的实验对金葡菌细胞壁的改变对金葡菌的毒性以及耐药性的影响可以为金葡菌的疫苗的研制提供一些线索。参考文献：1. 张桂芹,关盼香.不同培养时间的细菌革兰氏染色性与形态变化观察J.中外医疗,2009,28(14):168-168.DOI:10.3969/j.issn.1674-0742.2009.14.155.2. 尹秀华,王丽波,陶梅花等.常用抗菌药物对常见致病菌L型诱导的实验研究J.大理学院学3.
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