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1、ELISA原理ELISA 原理操作规则（新手适用）一实验目的酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay简称 ELISA）是在免疫酶技术（ immunoenzymatic techniques）的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术,ELISA 过程包括抗原（抗体）吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体（抗原）,再加相应酶标记抗体（抗原） , 生成抗原（抗体）待测抗体（抗原）酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体（抗原）的量。待测抗体（抗原）的定量与有色产物成正比。二实验原理用于免疫酶技术的酶有很多，如过氧化物
2、酶，碱性磷酸酯酶，半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰胆碱酯酶， 6磷酸葡萄糖脱氧酶等。常用于 ELISA 法的酶有辣根过氧化物酶 ，碱性磷酸酯酶等，其中尤以辣根过氧化物酶为多。由于酶摧化的是氧化还原反应， 在呈色后须立刻测定， 否则空气中的氧化作用使颜色加深，无法准确地定量。辣根过氧化物酶（HRP）是一种糖蛋白，每个分子含有一个氯化血红素（ protonhemin ）区作辅基。酶的浓度和纯度常以辅基的含量表示。氯化血红素辅基的最大吸收峰是 403nm，HRP酶蛋白的最大吸收峰是 275nm，所以酶的浓度和纯度计算式是（已知 HRP的 A（ 1cm 403nm 1%） 25，式中 1指 H
3、RP百分浓度为 100ml 含酶蛋白 1g，即10mg/ml，所以，酶浓度以mg/ml计算是 HRP的 A（ 1cm 403nm mg/ml=2.5 ）HRP纯度（RZ）=A403nm/A275nm纯度RZ（ einheit Zahl）值越大说明酶内所含杂质越少。高纯度 HRP的RZ值在3.0 左右，最高可达3.4 。用于ELISA 检测的HRP的RZ值要求在3.0 以上。ELISA 的基本原理有三条：（ 1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性；（ 2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其
4、免疫学和酶学活性；（ 3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否ELISA原理有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。ELISA 法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定，根据已经使用的结果，认为ELISA 法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点。不仅适用于临床标本的检查，而且由于一天之内可以检查几百甚至上千份标本 , 因此，也适合于血清流行病学调查。本法不仅可以
5、用来测定抗体，而且也可用于测定体液中的循环抗原，所以也是一种早期诊断的良好方法。因此ELISA 法在生物医学各领域的应用范围日益扩大，可概括四个方面：1 、免疫酶染色各种细胞内成份的定位。 2 、研究抗酶抗体的合成。3 、显现微量的免疫沉淀反应。4 、定量检测体液中抗原或抗体成份。基本方法一用于检测未知抗原的双抗体夹心法:1.包被：用 0.05M PH9. 牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1 10 gml 。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3 次，每次3 分钟。（简称洗涤，下同）。2.加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之
6、反应孔中，置37孵育1 小时。然后洗涤。（同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔）。3. 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀释度）0.1ml 。37孵育 0.5 1 小时，洗涤。4.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液 0.1ml ，37 10 30分钟。5.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸 0.05ml 。6. 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“ +”、“ - ”号表示。也可测 OD 值：在 ELISA 检测仪上，于 450nm（若以 ABTS显色，则 41
7、0nm）处，以空白对照孔调零后测各孔 OD值，若大于规定的阴性对照 OD值的 2.1 倍，即为阳性。基本方法二用于检测未知抗体的间接法：用包被缓冲液将已知抗原稀释至110 gml ， 每孔加 0.1ml ， 4过夜。次日洗涤3ELISA原理次。加一定稀释的待检样品（未知抗体）0.1ml 于上述已包被之反应孔中, 置 37孵育 1 小时 ,洗涤。（同时做空白、阴性及阳性孔对照）于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体（抗抗体）0.1ml ，37孵育 30-60 分钟，洗涤 , 最后一遍用 DDW洗涤。其余步骤同“双抗体夹心法”的 4、5、6。（二）酶与底物酶结合物是酶与抗体或抗原 , 半抗原在交联
8、剂作用下联结的产物。是 ELISA 成败的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应，还具有酶促反应，显示出生物放大作用，但不同的酶选用不同的底物。免疫技术常用的酶及其底物酶底物显色反测定波长应邻苯二胺橘红色492*四甲替联苯胺黄色460*氨基水杨酸棕色449辣根过氧化物酶邻联苯甲胺兰色4252,2 - 连胺基 -2 （ 3-乙基 - 并噻唑啉磺酸 -蓝绿色6426）铵盐4- 硝基酚磷酸盐黄色400（PNP）碱性磷酸酯酶萘酚 -AS-Mx 磷酸盐 +红色500重氮盐ELISA原理ABTS+HRP+葡萄糖黄色葡萄糖氧化酶葡萄糖 +甲硫酚嗪 +噻 405,420 深蓝色唑兰甲基伞酮基半乳糖苷荧光3
9、60,450- 半乳糖苷（4MuG）酶硝基酚半乳糖苷黄色420（ONPG）* 终止剂为 2mol/L H2SO4* 终止剂为 2 mol/L 柠檬酸， 不同的底物有不同的终止剂。可催化下列反应： HRP+H2O2复合物 复合物 +AH2过氧化物酶 +H2O+A AH2 为无色底物 , 供氢体； A 为有色产物。（三） ELISA 常用的四种方法1 直接法 测定抗原将抗原吸附在载体表面；加酶标抗体，形成抗原抗体复合物；加底物。底物的降解量抗原量。2 间接法 测定抗体将抗原吸附于固相载体表面；加抗体 , 形成抗原 - 抗体复合物；加酶标抗体；加底物。 测定底物的降解量抗体量。3双抗体夹心法 测定抗
10、原将抗原免疫第一种动物获得的抗体吸附于固相表面;加抗原，形成抗原- 抗体复合物 ;ELISA原理加抗原免疫第二种动物获得的抗体，形成抗体抗原抗体复合物 ; 加酶标抗抗体（第二种动物抗体的抗体） ; 加底物。底物的降解量抗原量。4. 竞争法 测定抗原将抗体吸附在固相载体表面 ;（ 1） 加入酶标抗原；（ 2）, （ 3）加入酶标抗原和待测抗原；加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差未知抗原量。三仪器和材料1.聚苯乙烯微量细胞培养板（平板, 40, 96孔）。2. 酶联免疫检测仪3. 辣根过氧化物酶羊抗兔 IgG, 工作稀释度 1:1000 。4.包被液 : ： 0.05mol/L pH9.6碳酸缓
11、冲液 ,4 ，保存 ,Na2CO3 0.15 克 , NaHCO30.293 克 , 蒸馏水稀释至100 ml 。5. 稀释液： 0.01mol/LpH7.4 PBS Tween 20, ，保存 . NaCl 8g, KH2PO40.2g, Na2HPO4.12H2O 2.9g, Tween 20， 0.5ml.蒸馏水加至1000ml。6. 洗涤液：同稀释液7. 封闭液： 0.5%鸡卵清蛋白， pH7.4 PBS。8. 邻苯二胺溶液（底物）：临用前配制0.1M 柠檬酸（ 2.1g/100ml ）, 6.1ml 0.2MNa2HPO4.12H2O （ 7.163g/100ml ）6.4ml,蒸馏
12、水 12.5ml,邻苯二胺 10mg, 溶解后 ,临用前加 30%H2O2 40 微升。9. 终止液： 2mol/LH2SO4。四 . 操作步骤1. 包被抗原：用包被液将抗原作适当稀释 , 一般为 1 10 微克 / 孔，每孔加 200 微升， 37温育 1 小时后， 4冰箱放置 16 18 小时。ELISA原理2. 洗涤：倒尽板孔中液体，加满洗涤液，静放三分钟，反复三次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽。3. 加封闭液 200 微升， 37放置一小时。4. 洗涤同 2。5.加被检血清：用稀释液将被检血清作几种稀释, ，每孔 200 微升。同时作稀释液对照。 37放置 2 小时。6. 洗涤同 2。7. 加辣根过氧化物酶羊抗兔 IgG, 每孔 200 微升 , 放置 37 1 小时。8. 洗涤同 2。9. 加底物：邻苯二胺溶液加 200ml，室温暗处 10 15 分钟。10. 加终止液：每孔 50 微升。11. 观察结果：用酶联免疫检测仪记录490nm读数。