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1、细菌形态学检查,1,细菌形态学检查及质量保证,细菌形态学检查,2,两个分隔的世界,微生物人员的无奈 标本采集不合格 有些病原菌难以生长或生长周期长 不是所有细菌都能做药敏试验 不是所有培养出的细菌都是致病菌 没有培养出细菌不代表没有感染 不是所有细菌或所有药物都有判断标准 临床医生不主动联系试验室人员,临床医生的抱怨 苛养菌检出率低 结果重复性差 报告速度慢 感染菌与污染菌不易区分 药敏结果与治疗反应存在差,细菌形态学检查,3,关注微生物报告时效性问题,操作最简单 费用最低 标本直接涂片 用时最短 显微镜检测 结果最直观 可在第一时间向临床报告镜下所见，医生根据镜检结果可作初步诊断，并以此进行
2、针对性用药。,细菌形态学检查,4,主要内容,标本涂片制作方法 常用染色方法及技巧 如何阅片,细菌形态学检查,5,标本涂片制作方法,痰液： 棉签挑取干酪样或脓性痰部分0.05-0.1ml，均匀涂抹成卵圆形痰 膜（约2cm长），每张玻片只涂一份标本 脓液：同痰涂片 大便：取粘液便或血便少量均匀涂布玻片，不可过厚 无菌体液：标本足量，1ml，离心或甩片集菌后涂片(3000r/min 15min） 标本量少，直接涂片 病灶组织或干酪块：先用组织研磨器磨碎后再涂片，大小厚度同痰涂片， 注意丝状真菌,细菌形态学检查,6,质量控制,涂片的厚薄以镜下见到单层细胞为宜 染色结果 细胞核、浆清晰，胞内吞噬物清楚可
3、见 革兰染色阴、阳性分明 涂片的制备水平及染色的质量，直接影响到镜检的结果,细菌形态学检查,7,标本染色方法及技巧,根据检测目标的不同选择最适合的染色方法,细菌形态学检查,8,革兰染色,涂片固定 待涂片干后加热固定，火焰固定时菌膜朝上，以中 等速度通过火焰3此即可（温度不宜过高，以防菌体蛋白 变性，影响染色结果），也可用乙醇或甲醇固定。 染色 龙胆紫 10s 水洗 甩干 碘液 10s 水洗 甩干 脱色液 10-20s 水洗 甩干 沙黄 10s 水洗 待干 镜检 油镜下观察，紫色革兰氏阳性 红色革兰氏阴性,细菌形态学检查,9,革兰染色注意事项,注意取材部位，涂片的厚薄。 染色时间应视标本种类、涂
4、片厚薄调整，妇科白带标本染色时间应烧延长（10s）,以获得更好的染色效果。脱色不宜过度。 固定不可用酒精灯直接加热，避免影响染色效果。 染液用完后及时改上盖子，避免挥发。 被检菌的培养条件、培养基条件、菌龄的不同影响染色效果，如培养时间过长，革兰阳性菌可能染成阴性。1824小时为宜。 某些菌存在染色困难，不易脱色的情况，出现染色不均，阴阳不定（某些G+b、鲍曼不动杆菌等）。 注意生物安全，自我防护。,细菌形态学检查,10,抗酸染色,涂片固定 同革兰染色 染色 石碳酸复红 10min 水洗 甩干 酸性酒精 1-2min 水洗 甩干 （必要时可重复） 亚甲基蓝 30s 水洗 待干 合格的片子肉眼观
5、察痰膜呈亮蓝色，无红色斑块 镜检 抗酸菌呈红色，背景及其他菌呈蓝色,细菌形态学检查,11,细菌形态学检查,12,抗酸染色注意事项,染色时避免玻片上的染液干燥 直接涂抹的痰膜厚薄适宜，以透过痰膜看报纸上的5号字迹较模糊为适宜的厚度 香柏油能溶解复红染料，使萋-尼氏染色褪色，并且容易干燥凝结，对油镜头造成伤害，故避免使用香柏油，应使用专用油镜油 酸性酒精用尽，可自制5%的盐酸酒精作为脱色液 有时同一个抗酸菌体上，红色的深浅亦有不同，镜检时注意 冬季室温过低，染色时间适当延长 试剂用完后及时盖好，避免挥发 注意生物安全，自我防护,细菌形态学检查,13,墨汁染色,标本（脑脊液）离心取沉淀涂片 在标本涂
6、片处滴加1滴墨汁，加盖玻片 在低倍镜下找有荚膜的菌细胞，转高倍或油镜确认 结果：新型隐球菌可见宽厚透亮的荚膜，细胞壁明显，有时有出芽现象，背景黑色 注意事项 脑脊液与墨汁的最适比例，墨汁太多影响观察 脑脊液离心后涂片，离心10-30min 痰液、支气管灌洗液均可作为隐球菌的检测标本，防止漏检,细菌形态学检查,14,乳酸酚棉蓝染色,在玻片上滴加1滴乳酸酚棉蓝染液 剪一段约1cm长的透明胶带，将一端贴在棉拭子木棒的一端，形成旗帜样 将胶带粘性一面按在菌落表面，将菌丝粘在胶带上并平放进入染液，取下木棒，再胶带表面再滴加一滴染液，盖上盖玻片 使用显微镜在低倍镜、高倍镜或油镜下观察真菌形态,细菌形态学检
7、查,15,科兹洛夫斯基染色,涂片，可混合大肠杆菌做对比，干燥、固定 滴加2%沙黄水溶液，略加热，使之冒蒸汽，约30s1min后水洗 1%孔雀绿染液复染23min，也可用碱性美蓝染色12min 吸水纸吸干后镜检 结果 布氏杆菌呈淡红色球杆菌，其它菌或细胞呈绿色或蓝色,细菌形态学检查,16,六胺银染色,涂片固定 染色 1%高碘酸，氧化10min，流水冲洗 2%铁明矾 10min,流水冲洗 玻片放入60预热20min的工作液中40min左右，每5min观察 一次，至涂片呈淡褐色，流水冲洗 0.2%氯化金调色35min，流水冲洗 2%硫代硫酸钠固定3min，流水冲洗 置60烤箱内烤干，封片 结果 油镜
8、下肺囊虫包囊呈圆形、卵圆形或不规则形，包囊呈黑色,细菌形态学检查,17,质量控制,每天质控与标本同步进行 一年一次人员比对，以当次比对职称最高人员结果为参考标准,细菌形态学检查,18,阅片,细菌形态学检查,19,如何阅片,标本合格与否的判定 感染的确认（炎症细胞） 炎症性质的鉴别（单个核、分叶核或嗜酸细胞） 感染性质鉴别（细菌、真菌、螺旋体、寄生虫等） 微生态失衡与否及程度（菌群失调） 可疑致病菌的确认（根据微生物与炎性细胞的关系）,细菌形态学检查,20,首先判断标本合格与否,开放性标本（痰液、尿液、伤口标本等） 肉眼观察（痰液粘稠、脓性、血性） 根据镜下细胞种类，数量及细菌种类判断 上皮细胞
9、多，炎症细胞少，多不合格,细菌形态学检查,21,强烈提示感染的镜下现象,吞噬现象 包括中性粒细胞的非特异性吞噬和巨噬细胞的特异性吞噬，与粘附区别,细菌形态学检查,22,包裹现象 有些病原微生物自身具有抗吞噬能力（荚膜），炎性细胞不能将 其吞噬，而是包裹起来，形成脓球,细菌形态学检查,23,伴行现象 未被炎性细胞包裹的病原菌分布在炎性细胞周围，需与污染菌鉴别,细菌形态学检查,24,建议,对大家公认有临床致病意义的细菌：结核分枝杆菌、非结核分枝杆菌、奴卡菌、白喉棒状杆菌、隐球菌等一经检出应立刻报临床。 对来自无菌部位的标本并排除污染的镜下细菌一经检出立刻报临床。 呼吸道及其他污染部位的条件致病菌（肺炎链球菌、嗜血杆菌、卡他莫拉菌铜绿假单胞菌、不动杆菌等）需结合镜下涂片及病人临床信息判断是否为致病菌。 直接涂片镜下观察 白细胞内吞噬细菌与感染相关度高 粘液丝缠绕或包裹的细菌可能为目的菌 未发现吞噬现象可结合标本类型、质量，细菌是否有荚膜，菌群改变或异位大量定植等分析,细菌形态学检查,25,谢谢,细菌形态学检查,26,此课件下载可自行编辑修改，供参考！ 感谢您的支持，我们努力做得更好！,