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1、液相色谱基础知识,一、色谱起源,HPLC的分离类型,正相色谱 (NP-HPLC) 反相色谱 (RP-HPLC) 反相离子对色谱 (RPIC) 离子交换色谱 (IEC) 空间排阻色谱 (SEC) 手性化合物分离模式(Chiral separation mode),液相色谱按两相极性不同分为: 正相色谱 反相色谱 化合物保留时间随流动相配比的变化 不同极性的化合物出峰顺序,正相HPLC色谱柱,硅胶型 氰基型 氨基型 糖类分析 二醇基型 蛋白质分析,Silica gel,Si,Si,-Si-CH2CH2CH2CN -Si-CH2CH2CH2NH2 -Si-CH2CH2CH2OCH(OH)-CH2(O
2、H),Modified Si,反 相 HPLC 色 谱 柱,C18 (ODS) type C8 (octyl) type C4 (butyl) type Phenyl type TMS type Cyano type,-Si-C18H37,Si,Non-polar property,色谱柱:非极性 溶剂: 极性 水 / 甲醇 / 乙腈,反 相 色 谱,保留时间和疏水性,OH,OH,C18 (ODS),Strong,Weak,固 定 相 作 用,C18 (ODS),Strong,C8,sample,sample,sample,C4,Medium,Weak,液相色谱流程图,输液泵,进样器,色谱柱,
3、柱温箱,检测器,溶剂,数据处理,流动相,流动相选择注意事项： 纯度：采用“ HPLC ”级溶剂 避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂 对试样有适宜的溶解度 溶剂粘度要小 与检测器相匹配 流动相配制时的顺序,溶 剂 等 级,水的等级 纯化水 蒸馏水 去离子水,波长 (nm),纯化水,去离子水,因为不纯物的存在，去离子的吸光率较高,纯化水中去除了无机和有机的污染物,吸光率,水 / MeOH梯度 ODS 柱,鬼峰,Gradient Curve,1 ml/min, 0-100% MeOH over 10 mins and hold for 15 mins.,溶 剂 等 级,鬼峰的出现,溶 剂 等
4、 级,溶剂的等级 HPLC级 优级纯 分析纯,都经过蒸馏和0.45u的过滤(除纤维毛,未溶解的机械颗粒,优级纯的纯度比分析纯大,但里面含有防腐剂和抗氧化剂,HPLC级经过0.2u的过滤,且除去有紫外吸收的杂质,微量分析、梯度洗脱,甲醇 乙睛 正己烷,分析纯级和 HPLC 级溶剂的吸光度比较图,溶 剂 等 级,溶剂前处理,过滤：0.45um或更小孔径滤膜 目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液。 过滤膜种类 水系过滤膜 有机系过滤膜,溶剂前处理,脱气 目的：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡 一般混合溶剂中能容纳的空气量往往要比单个溶剂所能容纳的空气总量要小
5、气泡对测定的影响： 1）柱压波动，流量偏小 2）基线波动,返回,流路中形成气泡引起的问题,改变保留时间和峰面积 流动相中形成气泡对液流的不良影响 泵中形成气泡使液流波动 峰变形 柱中气泡形成和累积使流动相绕流 尖峰或锯齿状噪声 检测池中气泡形成和累积产生基线噪声,输液泵,输液泵控制方式： 恒流控制 恒压控制,输液泵类型： 注射泵 柱塞往复泵 隔膜泵,柱塞往复泵,柱塞往复泵,优点 压力脉动小 易于更换溶剂 缺点 需要更换柱塞杆密封圈,等度洗脱,梯度洗脱,分析时间长,分离度差,MeOH / H2O = 6 / 4,MeOH / H2O = 8 / 2,( column : ODS type ),等
6、度洗脱,95%,30%,MeOH 浓度,梯度洗脱,梯度洗脱： 优点：可提高分离度、缩短分离时间、降低最小检测量和提高分离精度 注意事项： 溶剂的纯度要高，否则梯度洗脱的重现性差 梯度混合的溶剂互溶性要好 梯度洗脱应使用对流动相组成变化不敏感的选择性检测器（如紫外吸收检测器或荧光检测器），而不能使用对流动相组成变化敏感的通用型检测器（如示差折光检测器）,混合器,低压梯度比例阀,高压梯度,低压梯度,脱气机,高压/低压梯度系统,返回,高压梯度系统 梯度准确度好 系统复杂 (需两台或三台泵) 低压梯度系统 系统简单 需在线脱气机 存在时间滞后效应,高压/低压梯度系统,进样器,自动进样器 手动进样器 原
7、理：（六通阀） 注入方式： 1）全量注入 2）部分注入,返回,手动进样器的原理图,装填状态,进样状态,返回,进样体积,检测器响应值,定量管体积的一半,3倍定量管体积,全量注入,部分注入,进样体积与响应值关系,返回,柱温箱,分析结果重现性好 提高柱效 降低柱压 保证检测稳定性,柱温控制的优点：,色谱柱,1）柱压低于150kgf/cm2（15cm色谱柱） 2）柱温在40左右，最高使用温度为50 3）流动相PH使用范围为27.5,返回,ODS柱的使用注意点：,流动相注意点,离子对试剂的使用 具有缓冲盐流动相的使用 分析结束及开始 流动相平衡 加快平衡时间 异丙醇的使用,LC检测器,紫外可见检测器（U
8、V/VIS） 二极管阵列检测器（PDA） 示差检测器（RID） 电导检测器（CDD） 荧光检测器（RF） 电化学检测器（L-ECD） 质谱检测器（MS） 蒸发光散射检测器（ELSD）,紫外可见检测器,原理：基于被分析组分对特定波长紫外光的选择性吸收 定量基础：Lambert-Beer定律，AKCL 优点：1）对温度和流速变化不敏感 2）可用于梯度分析 缺点：仅适用于测定有紫外吸收的物质,紫外可见检测器,紫外可见检测器,岛津VP系列紫外检测器功能,1）设定时间程序（波长切换等） 2）双波长检测 3）比例色谱，初步判断峰的纯度 4）停泵扫描，确定组分最大吸收波长,NEXT,波长切换,返回,双波长检
9、测,返回,比例色谱,280nm,220 nm,ratio 280/220,返回,波长扫描,返回,二极管阵列检测器（SPDM10AVP）,二十一世纪标准紫外检测器 色谱信息： 保留时间 常规紫外检测器 紫外光谱 二极管阵列检测器,样品池,二极管阵列（512个单元）,光栅,D2 / W灯,每一单元可检测一个 波长下的吸光度,二极管阵列检测器,三维谱图,二极管阵列检测器的优点,1）采集三维谱图 2）峰纯度检验 3）光谱库检索,NEXT,峰纯度检验（3点光谱图比较）,Initial detection point,Final detection point,T1,T3,T2,peak top,up s
10、lope,down slope,1/2,1/3,乙酰水杨酸,下降点,上升点, 顶点,峰纯度检验（3点光谱图比较）,返回,光谱库检索,返回,检测器,原理：连续测定流通池中溶液折射率变化以测定 试样各组分浓度。 优点：通用型检测器 缺点：1）对温度和压力变化敏感 2）不能用于梯度分析,示差折光检测器,返回,糖的色谱图,Analytical Conditions Column : Shim-pack CLC-NH2 Mobile phase : Acetonitrile / water = 7 / 3 Flow rate : 1.0 mL/min Temperature : Ambient Peaks 1. 甘油 2. 木糖 3. 果糖 4. 葡萄糖 5. 蔗糖 6. 甘露糖 7. 乳糖,数据处理,岛津液相色谱数据处理单元： CLASSVP色谱工作站 CR6A色谱数据处理机 CR7A色谱数据处理机 CR8A色谱数据处理机,返回,液相色谱流程图,输液泵,进样器,色谱柱,柱温箱,检测器,溶剂,数据处理,