重组大肠杆菌产蔗糖磷酸化酶的酶学性质及其催化合成α-熊果苷.pdf

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1、 万月佳 等/重组大肠杆菌产蔗糖磷酸化酶的酶学性质及其催化合成 -熊果苷 Chinese Journal of Biotechnology December 25, 2012, 28(12): 14501459 2012 Chin J Biotech, All rights reserved Received: July 4, 2012; Accepted: September 11, 2012 Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 21076105), National Basic Research P

2、rogram of China (973 Program) (No. 2009CB724701), the Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions. Corresponding author: Jiangfeng Ma. Tel: +86-25-83172078; Fax: +86-25-84172062; E-mail: 国家自然科学基金 (No. 21076105)， 国家重点基础研究发展计划 (973 计划) (No. 2009CB724701)， 江苏高校优势学科建设工

3、程项目资助。 1450 生物工程学报 重组大肠杆菌产蔗糖磷酸化酶的酶学性质及其催化 合成 -熊果苷 万月佳，马江锋，徐蓉，贺爱永，姜岷，陈可泉，姜引 南京工业大学生物与制药工程学院 材料与化学工程国家重点实验室，江苏 南京 211816 万月佳, 马江锋, 徐蓉, 等. 重组大肠杆菌产蔗糖磷酸化酶的酶学性质及其催化合成 -熊果苷. 生物工程学报, 2012, 28(12): 14501459. Wan YJ, Ma JF, Xu R, et al. Properties of recombinant sucrose phosphorylase from Escherichia coli and

4、 enzymatic synthesis of -arbutin. Chin J Biotech, 2012, 28(12): 14501459. 摘 要: 利用重组大肠杆菌 Escherichia coli Rosetta(DE3)/pET-SPase 发酵生产蔗糖磷酸化酶 (EC 2.4.1.7， Sucrose phosphorylase，SPase)。收集的菌体经高压破碎后离心得到粗酶液，通过镍 NTA 亲和层析、超滤除盐 后得到电泳纯的 SPase，纯化后的 SPase 的比酶活是原来的 2.1 倍，酶活回收率达到 82.7。经 SDS-PAGE 电 泳测定，重组 SPase 的分子

5、量约为 59 kDa。该酶在不高于 37 ，pH 6.06.7 的条件下比较稳定，最适催化温 度与最适催化 pH 分别为 37 ，pH 6.7，该酶对蔗糖的米氏常数 (Km) 为 7.3 mmol/L，最大反应速率 (Vmax) 为 0.2 mol/(minmg)。此外文中还以蔗糖和氢醌为底物，利用重组 SPase 催化合成 -熊果苷。其最佳反应条件 为：20蔗糖，200 U/mL 的酶液，1.6氢醌，pH 6.06.5，25 ，反应 21 h。-熊果苷的摩尔产率为 78.3， -熊果苷的产量为 31 g/L。 关键词: 重组蔗糖磷酸化酶，纯化，酶学性质，-熊果苷 工业生物技术 万月佳 等/重

6、组大肠杆菌产蔗糖磷酸化酶的酶学性质及其催化合成 -熊果苷 1451 Properties of sucrose phosphorylase from recombinant Escherichia coli and enzymatic synthesis of -arbutin Yuejia Wan, Jiangfeng Ma, Rong Xu, Aiyong He, Min Jiang, Kequan Chen, and Yin Jiang State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering, College of

7、Biotechnology and Pharmaceutical engineering, Nanjing University of Technology, Nanjing 211816, Jiangsu, China Abstract: Sucrose phosphorylase (EC 2.4.1.7, Sucrose phosphorylase, SPase) can be produced by recombinant strain Escherichia coli Rosetta(DE3)/Pet-SPase. Crude enzyme was obtained from the

8、cells by the high pressure disruption and centrifugation. Sucrose phosphorylase was purified by Ni-NTA affi nity column chromatography and desalted by ultrafiltration. The specific enzyme activity was 1.1-fold higher than that of the crude enzyme, and recovery rate was 82.7%. The purified recombinan

9、t SPase had a band of 59 kDa on SDS-PAGE. Thermostability of the enzyme was shown at temperatures up to 37 C, and pH stability between pH 6.0 and 6.7. The optimum temperature and pH were 37 C and 6.7, respectively. The Km of SPase for sucrose was 7.3 mmol/L, and Vmax was 0.2 mol/(minmg). Besides, -a

10、rbutin was synthesized from sucrose and hydroquinone by transglucosylation with recombinant SPase. The optimal conditions for synthesis of -arbutin were 200 U/mL of recombinant SPase, 20% of sucrose, and 1.6% hydroquinone at pH 66.5 and 25 C for 21 h. Under these conditions, -arbutin was obtained wi

11、th a 78.3% molar yield with respect to hydroquinone, and the concentration of -arbutin was about 31 g/L. Keywords: recombinant sucrose phosphorylase, purification, properties, -arbutin 蔗 糖 磷 酸 化 酶 (EC2.4.1.7 ， Sucrose phosphorylase， SPase) 属于糖基水解酶 13 家族， 是一种催化转移葡萄糖苷键的酶，能够催化蔗糖 和无机磷酸盐合成 1-磷酸-葡萄糖1-2。该酶

12、主要 以蔗糖、1-磷酸-葡萄糖为供体，多类物质如多羟 基的糖和糖醇、酚羟基、羧基等为受体，催化合 成各种糖苷3。据报道，蔗糖磷酸化酶主要存在 于肠膜明串珠菌 Leuconostoc mesenteroides4、 变 异链球菌 Stococcus mutans5、嗜糖假单胞菌 Pseudomonas saccharophila6、 长 双 歧 杆 菌 Bifidobacterium longum7、 青 春 双 歧 杆 菌 Bifidobacterium adolescentis8等微生物中，通过 生物发酵获得，但由于产量和生产效率都比较 低，因此通过基因工程手段构建重组菌株，过量 表达蔗糖磷

13、酸化酶对于进行工业化大量生产十 分必要。 利用蔗糖磷酸化酶催化合成 -熊果苷是该 酶的重要应用之一。-熊果苷是一种新型的皮肤 增白剂，能够通过抑制酪氨酸酶的活性，从而减 少黑色素的生成，而对表皮细胞的正常生长以及 酪氨酸酶的表达没有影响， 并且其美白效果是 - 熊果苷 10 倍以上，是 21 世纪最有竞争力的美白 添加剂之一9-11。研究表明，-熊果苷只能通过 不同的微生物的酶进行糖转移反应，让一分子葡 萄糖和一分子的氢醌结合形成12。 本文利用重组菌株 E. coli Rosetta(DE3)/ pET-SPase13发酵生产 SPase， 并对其进行分离纯 化以及酶学性质的研究，此外还利用

14、该酶以氢醌 和蔗糖为底物催化合成 -熊果苷，其反应式如 图 1 所示。 ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q Chin J Biotech December 25, 2012 Vol.28 No.12 1452 图 1 重组 SPase 催化合成 -熊果苷14 Fig. 1 Synthesis of -arbutin catalyzed by recombinant SPase14. 1 材料与方法材料与方法 1.1 材料 重组菌 E. coli Rosetta(DE3)/pET-SPase 由本 实验室构建和保藏。标准品 -熊果苷购自 Sigma 公司，其余试剂均为国产分析

15、纯。 1.2 方法 1.2.1 大肠杆菌发酵产酶大肠杆菌发酵产酶 发酵培养基： 蛋白胨 12 g/L， 酵母粉 24 g/L， K2HPO4 72 mmol/L，MgSO4 10 mmol/L，硫胺素 0.034 g/L，微量元素 (CaCl26H2O 0.74 g/L， ZnSO47H2O 0.18 g/L，MnSO4H2O 20 g/L， Na2EDTA 20.1 g/L， CuSO4 0.1 g/L， CoCl2 0.104 g/L， FeSO47H2O 2 g/L) 2 mL/L。发酵条件：初始温度 37 ，当菌体生长至 OD600=3 时，连续流加乳 糖 (2 g/(Lh) 作为诱导

16、剂，诱导温度为 25 。 1.2.2 重组蔗糖磷酸化酶的纯化重组蔗糖磷酸化酶的纯化 发酵液离心 (4 ，8 000 r/min，15 min) 得 到的菌泥用 0.5 mol/L 磷酸钾缓冲液 (pH 6.5) 洗 涤并浓缩。浓缩后的菌液经高压破碎后离心 (4 ，12 000 r/min，30 min) 得到的上清液即为 粗酶液。 粗酶液经镍 NTA 琼脂糖凝胶色谱柱，采用 含 250 mmol/L 咪唑的磷酸缓冲液洗脱，洗脱液 用截留分子量为 10 kDa 的超滤离心管离心脱除 咪唑，得到纯酶液。 1.2.3 酶的最适温度的测定酶的最适温度的测定 将纯化的重组 SPase 置于 pH 6.7

17、 缓冲液中， 在不同的温度 (4 45 ) 下测定酶活， 以活力 最高者为 100对照。 1.2.4 酶的最适酶的最适 pH 的测定的测定 经纯化的重组 SPase 在 25 条件下，在不 同的 pH (5.09.0) 缓冲液中测定酶活，以活力最 高者为 100对照。 1.2.5 酶的温度稳定性的测定酶的温度稳定性的测定 将纯化的重组 SPase 置于 pH 6.7 缓冲液中， 在不同的温度 (4 45 ) 下保温 1 h，然后测 定其剩余酶活。以活力最高者为 100对照。 1.2.6 酶的酶的 pH 稳定性的测定稳定性的测定 将纯化的重组 Spase置于不同的 pH (5.58.0) 下，2

18、5 保温 1 h，然后测定其剩余酶活。以活 力最高者为 100对照。其中 pH 57 为柠檬酸 -Na2HPO4缓冲液，pH 78 为 Na2HPO4/NaH2PO4 缓冲液，pH 8.5 为甘氨酸-NaOH 缓冲液。 1.2.7 酶动力学常数的测定酶动力学常数的测定 在 pH 6.7，50 mmol/L 的磷酸缓冲液中分别 加入不同浓度的蔗糖 (210 mmol/L)， 约 9 U/mL 的酶液，25 反应 5 min，煮沸终止反应，利用 高效液相色谱 (HPLC) 分析产物果糖的浓度。 1.2.8 -熊果苷的合成熊果苷的合成 将 50 (W/V) 蔗糖，4 (W/V) 氢醌， 200 U/

19、mL 的酶液置于血清瓶中，调节 pH 至 万月佳 等/重组大肠杆菌产蔗糖磷酸化酶的酶学性质及其催化合成 -熊果苷 1453 6.06.5，25 水浴中避光反应 13 h。其中氢 醌的转化率() 12 1 100 MM M =%， 氢醌的选择 性() 12 100 M MM = %，熊果苷的摩尔产率 () 1 100 M M =%。 式中，M1：初始氢醌的摩尔质量，M2：残 余氢醌的摩尔质量，M：生成的 -熊果苷的摩尔 质量。 1.2.9 酶活力的检测酶活力的检测 参照 Silverstein 等6的方法， 通过测定反应过 程中释放的 NADPH 的量来计算。标准的测定体 系包括：50 mmol

20、/L 的磷酸二氢钾试剂 (pH 6.7)， 140 mmol/L 蔗糖溶液，1 mmol/L EDTA-2Na， 50 mmol/L MgCl2，1 mg 的 NADP+，l g 的 1,6-二磷酸葡萄糖， 100 g 的葡萄糖磷酸变位酶， 20 U 6-磷酸葡萄糖脱氢酶，20 L 的酶液，总体 积为 3.3 mL。25 ，340 nm 测定 NADPH 的吸 光值的变化。单位酶活的定义为在上述条件下每 分钟消耗 1 mol 的 NADP+所需的酶量。 1.2.10 蛋白质含量以及分子量的测定蛋白质含量以及分子量的测定 蛋白质含量的测定采用 Brandford 法15，测 定蛋白质的含量， 标

21、准蛋白为牛血清蛋白 (BSA)。 蛋白质分子量的测定采用十二烷基磺酸钠- 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)16，分离胶浓 度为 12.5，染色使用考马斯亮蓝 R-250。 1.2.11 果糖的检测果糖的检测 高效液相色谱 (HPLC) 检测果糖，检测条 件：色谱柱为氨基柱 (4.6 mm250 mm)，流动 相乙腈：水=7525，流速为 1 mL/min，示差 折光检测器。 1.2.12 -熊果苷的检测熊果苷的检测 高效液相色谱 (HPLC) 检测 -熊果苷，检 测条件：色谱柱为戴安 C18 (4.6 mm250 mm) 柱，流动相为 5的甲醇，柱温 25 ，检测波长 235 nm，流

22、速为 0.8 mL/min。 2 结果结果 2.1 蔗糖磷酸化酶的分离纯化 在 1.2.1 的条件下，发酵产重组 SPase 的酶 活达到 300 U/mL。该重组 SPase 在 N 端带有重 组融合的 His-Tag，因此可以采用金属离子螯合 的层析柱纯化酶蛋白。将重组 SPase 离心后进行 镍 NTA 亲和层析，然后用超滤离心管脱除咪唑。 经纯化后重组 SPase 的 SDS-PAGE 结果如图 2 所 示。 结果表明 SPase 纯度较高， 并且该重组 SPase 的分子量约为 59 kDa (包括 4 kDa 的组氨酸标 签)，与 L. mesenteroides ATCC1229

23、1 产的 SPase 的分子量接近17。蔗糖磷酸化酶的纯化倍数和 回收率见表 1，通过金属离子亲和层析和超滤离 心除盐后，SPase 的纯化倍数为原来的 2.1 倍， 酶活力回收率达到 82.7。 图 2 重组 SPase 纯化样品的 SDS-PAGE 分析 Fig. 2 SDS-PAGE analysis of purified recombinant SPase. M: molecular mass markers; 1: crude enzyme; 2: purified SPase. ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q Chin J Biotech December

24、 25, 2012 Vol.28 No.12 1454 2.2 pH 和温度对酶活力和稳定性的影响 pH 和温度对酶活力和稳定性的影响结果如 图 3。结果表明，酶的最适反应温度为 37 ；当 温度不高于 37 时，重组 Spase 的酶活力都比 表 1 重组 SPase 的纯化结果 Table 1 Purifi cation of recombinant SPase Step Total protein (mg) Total activity (kU)Specific activity (U/mg)Yield (%) Purification fold Rude enzyme 1 850 77

25、.4 41.8 100.0 1.0 Ni-NTA 820 68.6 83.7 88.6 2.0 Desalting 730 64.0 87.7 82.7 2.1 图 3 温度和 pH 对酶活力和稳定性的影响 Fig. 3 Effects of temperature and pH on activities and stabilities of recombinant SPase. : enzyme activity; : enzyme stability. 万月佳 等/重组大肠杆菌产蔗糖磷酸化酶的酶学性质及其催化合成 -熊果苷 1455 较稳定，置于相应的温度下 1 h 仍能保持 90以 上

26、的活力，温度超过 37 后，酶活力损失增加。 酶的最适作用 pH为 6.7； pH在 6.06.7的范围内， 重组 Spase 的酶活力都比较稳定。该重组 Spase 与 L. mesenteroides ATCC12291 产的 SPase 的性 质相似18。 2.3 重组 SPase 的动力学参数 本研究在最适反应条件下，进行了重组 SPase 对蔗糖的转糖基反应动力学分析，并以 Michaelis-Menten 方程拟合得到重组 SPase 对蔗 糖的反应动力学常数。 通过双倒数作图法， 以 r1 对 c1作图，结果如图 4 所示，可得重组 SPase 对蔗糖的米氏常数 (Km ) 为

27、7.3 mmol/L， 最大反 应速率 (Vmax) 为 0.2 mol/(minmg)。 图 4 重组 SPase 转糖基反应动力学 Fig. 4 Kinetics of glucosyl transfer reaction catalyzed by recombinant SPase. 2.4 以蔗糖和氢醌为底物合成 -熊果苷的反应 条件优化 2.4.1 温度对催化反应的影响温度对催化反应的影响 重组 SPase 在温度不高于 37 的条件下， 均能保持较高的活力。为此在其他条件不变的情 况下，只改变反应温度，观察其对氢醌转化率和 选择性的影响，结果如图 5 所示。25 37 条 件下，氢

28、醌的转化率变化不明显，但是温度高于 25 后， 氢醌的选择性随温度升高而下降。 此外 重组 SPase 在 25 条件下能够维持较高的酶活 力，因此选择 25 进行催化反应。 2.4.2 pH 对催化反应的影响对催化反应的影响 重组 SPase 在 pH 6.06.7 的范围内均能保持 较高的活力。为此在其他条件不变的情况下，只 改变反应 pH，观察其对氢醌转化率和选择性的 影响，结果如图 6 所示。在 pH 67 条件下，氢 醌的转化率比较稳定，但 pH 高于 6.5 时，氢醌 的选择性开始下降，此外重组 SPase 在 pH 66.5 条件下能够维持较高的酶活力，因此选择 pH 66.5

29、进行催化反应。 2.4.3 氢醌浓度对催化反应的影响氢醌浓度对催化反应的影响 当初始蔗糖浓度为 500 g/L 时，反应结束后 残留的蔗糖浓度过高，不仅造成了原料的浪费， 而且为以后 -熊果苷的分离带来了困难， 因此选 择初始蔗糖浓度为 200 g/L，该浓度下对下游有 机膜超滤分离无影响。理论上，蔗糖和氢醌合成 -熊果苷的摩尔比为 11， 但该反应是一个可逆 反应，并且氢醌成本相对蔗糖高、具有一定的毒 性，因此反应中应使蔗糖过量，促使氢醌得到最 高的转化率。 在初始蔗糖浓度 200 g/L 的条件下， 考察不同蔗糖氢醌浓度比对催化反应的影响，结 果如图 7 所示。随着蔗糖氢醌浓度比的下降，氢

30、 醌的转化率和选择性均下降，这是由于氢醌浓度 越低，蔗糖越过量，促进反应正向进行，使得氢 醌更大程度地转化。因此选择 1.6的氢醌 (对 应蔗糖与氢醌的摩尔比为 41) 进行催化反应。 ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q Chin J Biotech December 25, 2012 Vol.28 No.12 1456 图 5 温度对生产 -熊果苷的影响 Fig. 5 Effect of temperature on production of -arbutin. 图 6 pH 对生产 -熊果苷的影响 Fig. 6 Effect of pH on production o

31、f -arbutin. 万月佳 等/重组大肠杆菌产蔗糖磷酸化酶的酶学性质及其催化合成 -熊果苷 1457 图 7 氢醌浓度对生产 -熊果苷的影响 Fig. 7 Effect of concentrations of hydroquinone on production of -arbutin. 2.4.4 反应时间对催化反应的影响反应时间对催化反应的影响 反应时间对催化反应的影响如图 8 所示。随 着反应的不断进行，氢醌的转化率逐渐上升，至 21 h 转化率基本达到最大，21 h 后转化率变化不 明显，一方面可能是由于反应达到平衡，另一方 面可能是由于反应时间过长，酶活力下降，因此 将反应时间

32、控制在 21 h。 3 讨论讨论 SPase 作为一种葡萄糖基转移酶，其重要作 用在于能够以蔗糖或 1-磷酸-葡萄糖为供体，多 类物质如多羟基糖和糖醇、酚羟基、羧基等为受 体，催化合成其相应的多一个葡萄糖基的糖苷， 因此 SPase 具有较高的研究价值。本文利用自行 构建的重组 E. coli Rosetta(DE3)/pET-SPase 进行 发酵生产重组 SPase，利用 Ni-NTA 柱亲和层析 来分离纯化重组 SPase，纯化方法简单，得到的 图 8 反应生成 -熊果苷的进程 Fig. 8 The process to produce -arbutin. ISSN 1000-3061

33、CN 11-1998/Q Chin J Biotech December 25, 2012 Vol.28 No.12 1458 重组 SPase 酶活力较高，且酶活损失较少。同时 对重组 SPase 的酶学性质进行研究，并在此基础 上利用该重组 SPase 以氢醌和蔗糖为底物催化合 成 -熊果苷。在最适条件 (200 U/mL 的重组 SPase，蔗糖浓度 20 (W/V)，氢醌浓度 1.6 (W/V)，pH 6.06.5，25 水浴，避光) 下，氢醌 的转化率接近 90，-熊果苷的摩尔产率为 78.3，产量达到 31 g/L。与已报道的其他生产 -熊果苷的方法相比，利用该法生产 -熊果苷的

34、产量高，使用的原料蔗糖和氢醌的量均比较少。 表 2 各种合成 -熊果苷方法的比较 Table 2 Comparison of -arbutin synthesis by different methods Enzyme Dornor AcceptorD:A ratio Yield (%) Product amount (g/L) -Amylase19 MaltopentoseHQ 1:1.920 6.5 -Glucosidase20 Maltose HQ 167:1 14.0 0.34 Lyophilized cell21 ( Xanthomonas campestris) Maltose H

35、Q 27:1 90.0 11.434 SPase22 Sucrose HQ 16:1 60.0 14.83 Dextransucrase23 Sucrose HQ 1:1 0.4 0.54 Amylosucrase24 Sucrose HQ 10:1 90.0 0.56 E. coli cells anchoring surface-displayed transglucosidase25 Maltose HQ 12:1 76.0 21.00 Xanthomona maltophilia BT-11214 Sucrose HQ 2:1 94.3 12.33 Aspergillus oryzae

36、 PL1126 Maltose HQ 3:1 7.2 1.33 Intracellular Crude Enzyme (Xanthomonas campestris pv. campestris 8004)27 Sucrose HQ 30:1 60.1 6.58 This study Sucrose HQ 4:1 78.3 31.00 REFERENCES 1 Janecek S, Svensson B, Henrissat B. Domain evolution in the -amylase family. J Mol Evol, 1997, 45(3): 322331. 2 Lee JH

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