色谱分析法导论.ppt

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1、第十五章 色谱分析法导论,15-1 概述,一、 色谱法（Chromatography） 利用样品在两相间的分配来分离、分析多组分混合物的技术。 色谱法是一种物理化学分析方法，它利用混合物中各物质在两相间分配系数的差别，当溶质在两相间作相对移动时，各物质在两相间进行多次分配，从而使各组分得到分离。,1. 色谱法的产生及发展 色谱法是一种分离技术，它是俄国植物学家茨维特1906年创立的。分离植物叶子中的色素时，将叶片的石油醚（饱和烃混合物）提取液倒入玻璃管中，柱中填充CaCO3粉末（CaCO3 有吸附能力)，用纯石油醚洗脱（淋洗）。色素受两种作用力影响。,（1）一种是CaCO3 吸附，使色素在柱中

2、停滞下来 （2）一种是被石油醚溶解，使色素向下移动 各种色素结构不同，受两种作用力大小不同，经过一段时间洗脱后，色素在柱子上分开，形成了各种颜色的谱带，这种分离方法称为色谱法。,固定相 (stationary phase ): CaCO3颗粒 流动相 (mobile phase): 石油醚,茨维特在当时的实验中观察到4个色带，它们分别是胡萝卜素、叶黄素和叶绿素A和B。 随着被分离样品种类的增多，该方法广泛地用于无色物质的分离，“色谱”名称中的“色”失去了原有的意义，但“色谱”这一名称沿用至今。,1906年茨维特在德国植物学杂志发表文章，首次命名上述分离后色带为色谱图，称此方法为色谱法。 195

3、2年Martin和Synge因色谱的理论与应用研究获得诺贝尔化学奖。,1952年，Martin和James发表第一篇气液色谱论文，首次用气体作流动相，配合微量酸碱滴定，发明了气相色谱，它给挥发性化合物的分离测定带来了划时代的革命。Van Deemter等对色谱理论的研究极大地促使色谱技术的发展。 1955年，第一台商品气相色谱问世，标志着现代色谱分析的建立。,1956年，荷兰的Van Deemter在总结前人工作的基础上提出速率理论。 1957年戈雷(Golay)发表“涂壁毛细管气液分配色谱理论和实践”论文，实现了毛细管气相色谱分离。 1979年弹性石英毛细管应用于气相色谱。80年代将固定液固

4、载化是毛细管色谱技术的又一个重要发展。它大大提高了色谱柱的稳定性, 延长了柱寿命, 提高了色谱性能 。,二. 色谱法的分类,1. 按两相所处的状态分类,气相色谱 (GC) 液相色谱 (LC),按流动相的状态分类,适用于气体和低沸点有机化合物的分析，仪器简单，操作方便，应用广泛。可在不同操作温度条件下使用。,按固定相不同又分为,气固色谱 (GSC) 气液色谱 (GLC),液相色谱,液固色谱 (LSC) 液液色谱 (LLC),适用于高沸点、不易气化的、热不稳定及生物活性物质的分析，通常在室温条件下工作。,2. 按固定相所处的外形分类,平板色谱,填充柱色谱 毛细管柱色谱,薄层色谱和纸色谱,柱色谱,3

5、. 按组分在两相间的分离机理分类,吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、空间排阻色谱、毛细管电泳,三、色谱法的特点,1. 分离效率高,复杂混合物、性质相近的有机同系物及旋光异构体等。 对于那些性质极为相似的组分, 如同位素、同分异构体, 采用高选择性固定相，使它们之间的分配系数产生足够大的差异, 从而实现良好分离。,多种高灵敏检测器，痕量杂质分析的有力工具。可以检测出ppt(10-9)级甚至ppb(10-12)级。,2. 灵敏度高,4. 应用范围广,可分析有机或无机的气、液、固体试样,组分的定性较为困难,缺点：,3.分析速度快,解决方法：发展联用技术,四. 气相色谱分析法与其它方法比较 1. 气相

6、色谱法与分馏法的比较 色谱分离比分馏快，得到的物质纯度比分馏法高。石油化学家采用分馏法花了20多年才鉴别出石油中的200余种组分，而当今采用毛细管GC仅需数小时即可完成。,苯和环己烷的沸点仅差0.6，如用精馏分离柱进行分离是不可能的。,2.气相色谱法与经典化学分析的比较 化学分析根据物质具有某种独特的化学性质来进行测定, 而色谱分析能使许多化学性质相同/相似的复杂组分相互分离后测定。 3.气相色谱法与光谱、质谱分析法的比较 光谱、质谱主要是定性分析工具, 色谱是分离分析的工具。色谱法的最大优越性在于它最擅长分离分析多组分的复杂体系。,15-2 色谱分离原理,热力学因素： 分配系数 动力学因素：

7、组分在色谱柱的扩散和传质,色谱分离过程简述 在色谱分析中，当流动相携带样品通过固定相时，样品分子与固定相分子之间发生相互作用，使样品分子在流动相和固定相之间进行分配。与固定相分子作用越大的组分向前移动越慢，与固定相分子作用越小的分子向前移动速度越快，经过一定距离后，由于反复多次的分配（柱色谱为103106次），使原本性质（沸点、极性等）差异很小的组分之间也可得到很好的分离。,分配系数的微小差异吸附能力的微小差异 微小差异积累较大差异作用能力弱的组分先流出； 作用能力强的组分后流出,一、分离原理,固定相是多孔性的固体吸附剂颗粒，其分离是基于固体吸附剂对试样中各组分的吸附能力的不同；,1. 气固色

8、谱:,固定相由担体和固定液所组成，固定液涂敷在担体表面，其分离混合物是基于固定液对试样中各组分的溶解能力的不同。,2. 气液色谱:,试样中的各组分K值不同是分离的基础,二、分配系数和分配比,1. 分配系数K (distribution coefficient),在一定温度和压力下，组分在两相间分配达到平衡时的浓度比，称为分配系数。,一定温度和压力下，K越大，出峰越慢,2. 分配比 k (distribution ratio),在一定温度和压力下，组分在两相间分配达到平衡时，分配在固定相和流动相中的质量之比。,k值越大，说明组分在固定相中的量越多，相当于柱的容量大，因此又称分配容量。它是衡量色谱

9、柱对被分离组分保留能力的重要参数。k值也取决于组分及固定相热力学性质。它不仅随柱温、柱压变化而变化，而且还与流动相及固定相的体积有关。,3、分配系数和分配比之间的关系 分配系数K与柱中固定相和流动相的体积无关，而取决于组分及两相的性质，并随柱温、柱压变化而变化。 容量因子k决定于组分及固定相的热力学性质，随柱温、柱压的变化而变化，还与流动相及固定相的体积有关。,理论上可以推导出：,Phase ratio(相比，b): 反映各种色谱柱柱型及其结构特征 填充柱（Packing column）: 635 毛细管柱（Capillary column）: 501500,三、气相色谱流出曲线,1.基线 (

10、baseline),色谱柱中仅有流动相通过检测器时，所检测到的信号。,2.峰高,从色谱峰顶点到基线之间的垂直距离。,3. 区域宽度,1）半峰宽（Y1/2）：,2）峰底宽（Wb）,色谱峰高一半处的宽度,色谱峰两侧拐点上的切线在基线上截距之间的距离。,气相色谱流出曲线,4.保留值 (retention value),1）用时间表示的保留值,保留时间(tR)：组分从进样到柱后出现浓度极大值时所需的时间。,不与固定相作用的气体的保留时间。,调整保留时间(tR )： tR = tRtM,死时间( dead time, tM)：,2）用体积表示的保留值,组分从进样到柱后出现浓度极大值时所通过的流动相体积,

11、VR = tRF0,色谱柱内未被固定相占据的空隙体积,调整保留体积(VR)： VR = VR VM,死体积(VM)：,VM = tM F0,保留体积(VR)：,tR = tM (1+k ),3）相对保留值 r21,又称选择因子，只与柱温和固定相性质有关,表示了固定相对这两种组分的选择性,6.保留值与分配比 k 的关系,5.保留值与分配系数K的关系,色谱峰反映的信息：,1）根据峰的个数，判断样品中所含最少的组分数,2）根据保留值对色谱峰进行定性分析,3）根据峰高或面积进行定量分析,15-3 色谱法基本理论,塔板理论 (plate theory) 速率理论 (rate theory),一、塔板理论

12、,塔板理论把色谱柱比作一个分馏塔，假设柱内有n个塔板，每个塔板高度称为理论塔板高度，用H表示，在每个塔板内，试样各组分在两相中分配并达到平衡，最后，挥发度大的组分和挥发度小的组分彼此分离，挥发度大的最先从塔顶（即柱后）逸出。尽管这个理论并不完全符合色谱柱的分离过程，色谱分离和一般的分馏塔分离有着重大的差别，但是因为这个比喻形象简明，因此几十年来一直沿用。,理论假设：,1）色谱柱由一块一块的虚拟塔板组成，在一个塔板内组分在气液两相间可以很快达到平衡；,2）塔板内一部分空间由固定相占据，另一部分由流动相占据，称为板体积；,1941 Martin,5）分配系数在各塔板上是常数。,3）载气进入色谱柱不

13、是连续而是脉动的，每次进气为一个板体积；,4）试样沿色谱柱方向的扩散可以忽略不计；,设色谱往由5块塔板（n5，n为色谱柱的塔板数）组成，并以r表示塔板编号，r0，1，2，nl；某组分的分配比k=1，根据上述假定，在色谱分离过程中，该组分的分布可计算如下：开始时，若有单位质量的，即m1的组分加到0号塔板上，分配平衡，即mSmM0.5。,色谱流出曲线,将离开色谱柱物质的量作纵坐标，载气塔板体积做横坐标得到色谱图,随着脉冲载气的加入，组分从色谱柱出口流出进入检测器。实际上，组分在柱内的分布就是二项式的展开式：,P为组分分配在液相中的质量，q为组分分配在气相中的质量。当n100，流出曲线的形状就呈高斯

14、分布，一般气相色谱柱的n 约为103106。,对于色谱过程而言，n很大，采用数学上近似处理方法，可推导色谱流出曲线上任意一点样品的浓度值：,C色谱流出曲线上任意一点样品的浓度； n理论塔板数； m溶质的质量； VR溶质的保留体积； V色谱流出曲线上任意一点的保留体积,决定色谱峰最大浓度的因素：,l进样量越大，峰高越大； l相同保留时间，塔板数越大，峰高越大； l固定进样量和塔板数，保留时间越小，色谱峰高且窄；反之，保留时间长的组分色谱峰低且宽。,由流出曲线方程可推出：,而理论塔板高度（H）即：,注意：同一色谱柱用不同物质计算可得到不同的塔板数。,有效塔板数,有效塔板高度,塔板理论的优点:,塔板

15、理论是一种半经验理论，它初步揭示了色谱分离过程。塔板理论在色谱中的意义在于： 色谱流出曲线符合高斯峰分布； 塔板数作为衡量柱效指标是有效的； 浓度极大点的位置Cmax符合实验结果。,2.用有效塔板数和有效塔板高度作为衡量柱效能的指标时，应指明测定物质。,1. 柱长一定，有效塔板数 n 越大，被测组分在柱内被分配的次数越多，柱效能越高。,3. 柱效不能表示被分离组分的实际分离效果。,塔板理论假设的缺点： 在气相色谱中，忽略分子纵向扩散； 流动相的运动是跳跃式的、不连续的假设显然违背了实际色谱过程； 实际色谱过程难于达到真正的平衡状态； 分配系数与浓度无关只在一定的范围内成立。,塔板理论的最大缺点

16、： 说明不了色谱流出曲线峰展宽的本质及曲线形状变化的影响因素； 说明不了各种实验操作条件变化所引起的色谱峰峰宽变化的原因； 无法把各种色谱参数与塔板高度定量地关联起来，特别是不能解释流速对柱效率的影响。,综上所述：塔板理论虽为半经验理论，但在色谱学发展中起到了率先作用和对实际工作的指导作用。,2. 速率理论,前面已知，用塔板理论来说明色谱柱内各组分的分离过程并不合理，因为色谱柱内并没有塔板。当同一试样进入同一色谱柱，当流动相速度变化时，得到不同的色谱图。测得的 n 和 H 也不同，充分说明塔板理论不足以说明色谱柱的分离过程。,1956年荷兰学者Van Deemter等人在研究气液色谱时提出色谱

17、过程的动力学理论，它是在吸收了塔板理论中塔板高度概念的同时，考虑了影响塔板高度的动力学因素，指出理论塔板高度是峰展宽的量度，导出了塔板高度H与载气线速度u的关系式，即速率理论。,二、速率理论影响柱效的因素,H = A + B/u + Cu,H：理论塔板高度,u：载气的线速度(cms-1),A：涡流扩散项：,B：分子扩散项系数,C ：传质阻力项系数,荷兰 Van Deemter,1. 涡流扩散项 (eddy diffusion),气体碰到填充物颗粒时，不断改变流动方向，使试样在气相中形成类似“涡流”的流动，引起色谱峰的扩张。,A = 2dp,：固定相的填充不均匀因子,dp：固定相的平均颗粒直径,

18、固定相颗粒越小dp，填充的越均匀，A，H，柱效n,对于毛细管柱，A = 0,涡流扩散项系数,2. 分子扩散项 (molecular diffusion),B = 2 Dg, ：组分分子在柱内扩散路径的弯曲程度 有关的因子,Dg：试样组分在气相中的扩散系数(cm2s-1),填充柱色谱: = 0.5 0.7,毛细管柱: = 1,流速，滞留时间，扩散因子,扩散系数：Dg M载气-1/2 ； M载气，B值,分子扩散项系数,分子扩散项B/u（纵向扩散项）,减小纵向扩散项u 采取措施： 适当提高流动相流速u，减小保留时间 用相对分子质量较大的气体作流动相。 适当降低柱温c 。,3. 传质阻力项,传质阻力系

19、数C等于气相传质阻力系数Cg和液相传质阻力系数Cl之和：,C = Cg+ Cl,气相传质阻力：是指组分分子由气相移动到气液两相界面进行交换，这一传质过程中所受到的阻力。,固定相颗粒越小 dp，Cg；Dg， Cg,Dl为组分在液相中的扩散系数， Dl， Cl,液相传质阻力：组分分子由气液两相界面扩散至固定液内部，进行质量交换达到分配平衡后，再返回气液两相界面的传质过程中所受到的阻力。,df为固定相液膜厚度， df，Cl,传质阻力项Cu,减小采取措施： 采用粒度小的填充物 Cgdp2 相对分子质量小的载气，DG大。 Cg1/DG 降低固定液液膜厚度(Cldf2)并且液膜要均匀；若膜厚，扩散，费时；

20、但不能太薄，否则包不住载体。 DL越大越好，增加柱温是提高DL的方法之一。,范氏方程讨论：H=A+B/u+Cu 作Hu图,讨论 1.曲线有一最低点 uopt (即Hmin) 将方程微分: 2.对开管柱(毛细柱) A=0 得Golay方程 H=B/u+Cu 对填充柱A项与u无关,决定于柱的填充情况,3. u很小时：Cu项可忽略,方程简化为: H = A + B/u 作H1/u直线,斜率为B 分子扩散项对H影响大 4. u很大时: B/u项可忽略,方程简化为: H = A + Cu 作Hu直线,斜率为C，截距A 传质阻力项对H影响大 5. k 对板高H的影响(比较复杂): n随k的变化而变化,综合

21、考虑: u实际稍高于uopt 因为:1.右侧曲线斜率小,u稍变 不会引起H的大变化 2. 为提高分析速度 因为u 则tR ,讨论：影响柱效的因素,1）被分离组分在色谱柱内的涡流扩散、分子扩散及传质阻力是造成色谱峰扩展，柱效下降的主要原因。,4）各种因素相互制约，选择最佳条件，才能使柱效达到最高。,3）通过选择适当的固定相粒度、载气种类、液膜厚度及载气流速可提高柱效。,2）速率理论为色谱的 分离和操作条件的选择提供了理论指导。,15-4 分离度,单独用柱效能或单独用选择性都不能反映组分的实际分离效果,因此引入综合性指标分离度,影响因素：,一、分离度的定义,区域宽度色谱过程的动力学因素决定,保留值

22、之差色谱过程的热力学因素决定,色谱分离关系式 设两相邻峰的峰宽相等，即w1 = w2，k1= k2,又根据塔板理论得知：, 选择性较差，柱效低，分离效果更差。,柱效较高，选择性较好,完全分离；, 选择性 较差，柱效较高，基本完全分离,选择性 较好，但柱效较低，分离的不好；,Rs=1，分离程度98%；Rs=1.5，达99.7%,二、柱效能、选择性与分离度的关系,柱效能n有效越大，越有利于分离；,选择性r21是两种组分能否分离的依据；,分离度Rs是色谱柱的总分离效能指标，可以判断物质在色谱柱中的分离情况，反应了柱效能与选择性影响的总和。,柱效能n有效很大，选择因子r21接近于1，可能分不开 柱效能

23、n有效很大，选择因子r21很大，分离得很好 柱效能n有效很大，选择因子r21等于1，一定分不开 柱效能n有效很小，选择因子r21接近于1 ，一定分不开 柱效能n有效很小，选择因子r21很大，可能分开,例：在一定条件下，两个组分的保留时间分别为90秒和105秒，死时间为5秒，要达到完全分离，计算需要多少块有效塔板。若填充柱的塔板高度为0.1cm，柱长应是多少？,解：,r21= (105-5) / (90-5) = 1.18,= 161.52(1.18/0.18)2,n有效 = 16Rs2 r21/(r211)2,= 1547（块）,L有效 = n有效H有效 = 15470.1,= 155 cm,

24、15-5 气相色谱定性分析,一、利用纯物质对照定性,比较试样中具有与纯物质相同保留值的色谱峰，来确定试样中是否含有该物质。,二、利用加入纯物质峰高增加定性,将纯物质加入到试样中，观察各组分色谱峰的相对变化，峰高增加的组分可能为这种纯物质。,三、利用相对保留值定性,相对保留值r21仅与柱温和固定液性质有关,四、利用保留指数定性,保留指数又称Kovats指数，是一种重现性较好的定性参数。,将正构烷烃作为标准，规定其保留指数为分子中碳原子个数乘以100（如正己烷的保留指数为600）。,保留指数测定方法：,通过选定两个相邻的正构烷烃，其分别具有Z和Z1个碳原子。被测物质X的保留时间应在相邻两个正构烷烃

25、的保留值之间,色质谱联用仪；色谱-红外光谱仪联用仪,五、利用与其他分析仪器联用的定性方法,15-6 气相色谱定量分析,一、 峰面积的测量,1. 峰高乘半峰宽法,A = 1.065 hY1/2,2. 峰高乘平均峰宽法：,A = h Y1/2,A = h (Y0.15 + Y0.85 ) / 2,峰形对称，且不太窄,不对称峰,3. 峰高表示峰面积法：,4. 自动积分和微机处理法：,自动处理数据，报出分析结果,峰形狭窄时，峰高定量法比面积定量法更准确,二、 定量校正因子,1.绝对校正因子,物理意义：单位面积对应的物质量,fi与仪器灵敏度及操作条件有关，不易准确测定，也无法直接应用,2.相对校正因子,

26、组分的绝对校正因子f i与标准物质的绝对校正因子f s之比。,1）质量校正因子,相对校正因子与操作条件、仪器灵敏度无关,2）摩尔校正因子,标准物：,FID 正庚烷,TCD 苯,仅适用于试样中所有组分全部出峰的情况,三、常用的定量方法,1. 归一化法,2. 外标法,外标法不使用校正因子，准确性较高，但操作条件变化对结果准确性影响较大,标准曲线法,3. 内标法,适用于试样中所有组分不能全部出峰的情况， 或仅对某几个组分进行定量,mi待测组份的质量 m试样质量 ms 内标物的质量,将内标物准确称量加入到准确称量的试样中，,内标物的要求：,2）与被测组分性质比较接近；,3）不与试样发生化学反应；,4）出峰位置应位于被测组分附近，且对各组分的峰无影响。,1）试样中不含有该物质；,准确性较高，操作条件和进样量的稍许变动对定量结果的影响不大。,特点；,若将内标法中的试样取样量和内标物加入量固定，则：,准确称取一定量的试样m，加入一定量内标物mS,试样配制：,