色谱分析法引论.ppt

《色谱分析法引论.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《色谱分析法引论.ppt（49页珍藏版）》请在三一文库上搜索。

1、第三章 色谱分析法引论,内容提要：,第一节 色谱法概述 第二节 色谱法基本术语 第三节 色谱法基本理论,第一节 色谱法概述,一、色谱分析法的基本原理 二、色谱分析法的分类 三、色谱分离过程 四、色谱法的特点,一、色谱分析法的基本原理,1、色谱法的起源 俄国植物学家茨维特在1906年使用的装置：色谱原型装置，如图。 植物色素分离实验：在一玻璃管中放入碳酸钙，将含有植物色素（植物叶的提取液）的石油醚倒入管中。此时，玻璃管的上端立即出现几种颜色的混合谱带。然后用纯石油醚冲洗，随着石油醚的加入，谱带不断地向下移动，并逐渐分开成几个不同颜色的谱带，继续冲洗就可分别接得各种颜色的色素，并可分别进行鉴定。色

2、谱法也由此而得名。,其中装填了填料的玻璃管称为色谱柱； 柱中的填料物质称为固定相； 相对于固定相运动、流经固定相的空隙或表面的冲洗溶剂称为流动相。 现在的色谱法早已不局限于色素的分离，其方法也早已得到了极大的发展，但其分离的原理仍然是一样的。我们仍然叫它色谱分析。,2、色谱法的原理,色谱法也称层析法，是一种将混合物样品的各组分进行分离，然后顺序检测各组分的分离与分析技术。 色谱法是一种分离技术： 试样混合物的分离过程也就是试样中各组分在称之为色谱分离柱中的两相间不断进行着的分配过程。 其中的一相固定不动，称为固定相； 另一相是携带试样混合物流过此固定相的流体（气体或液体），称为流动相。,当流动

3、相中携带的混合物流经固定相时，其与固定相发生相互作用。由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随着流动相的移动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，使得各组分被固定相保留的时间不同，从而按一定次序由固定相中流出。,与适当的柱后检测方法结合，实现混合物中各组分的分离与检测。 两相及两相的相对运动构成了色谱法的基础,二、色谱分析法的分类,（一）按固定相和流动相所处的状态分类 1、气相色谱法（GC） 以气体为流动相的色谱法称为气相色谱法(GC)。 按照固定相的状态又可将气相色谱法分为： 气-液色谱法：以气体为流动相，以涂在载体表面的液体为固定相的色谱法。

4、气-固色谱法：以气体为流动相，以固体为固定相的色谱法。 气相色谱法中流动相常称为载气。,2、液相色谱法（LC） 以液体为流动相的色谱法称为液相色谱法。 同理，按照固定相的状态又可将液相色谱法分为： 液-固色谱法：前者是以液体为流动相，以固体为固定相的色谱法。 液-液色谱法：后者是以液体为流动相，以涂在载体表面的液体为固定相的色谱法。,（二）按固定相的形式分类,1、柱色谱：固定相装在色谱柱中。液体或气体流动相从柱头向柱尾连续不断地冲洗。 共分为两大类： 填充柱色谱：固定相装在一根玻璃或金属管内； 毛细管柱色谱：固定相附着在一根细管内壁上，管中心是空的，也叫开管柱色谱。 上述对植物色素的分离即是经

5、典的填充柱色谱法。,2、纸色谱：利用滤纸作载体，吸附在纸上的溶剂作固定相。液体流动相从薄层板一端向另一端扩散。 3、薄层色谱：将固体吸附剂在玻璃板或塑料板上制成薄层作固定相。液体流动相从薄层板一端向另一端扩散。,纸色谱和薄层色谱总称平面色谱，平面色谱是靠滤纸或硅胶层的毛细管作用将流动相从一端吸上来，使样品组分得以分离。,（三）按分离原理分类,1、吸附色谱法：用吸附剂作固定相，利用吸附剂（一般是固体）表面对不同组分吸附能力的不同，因而吸附平衡常数不同而将组分分离的色谱法，包括气-固吸附色谱法和液-固吸附色谱法。 2、分配色谱法：用液体作固定相，利用不同组分在液体固定相和流动相中的溶解度不同，因而

6、分配系数不同而进行分离的色谱法，包括气-液分配色谱法和液-液分配色谱法。,3、离子交换色谱法：固定相为离子交换剂，利用离子交换剂与不同离子交换能力的不同，因而选择性系数不同而进行分离的色谱法。只有液相离子交换色谱。 4、凝胶色谱法（尺寸排阻色谱法）：利用多孔性物质作固定相，因其对不同大小分子的排阻作用不同，因而渗透系数不同而进行分离的色谱法。只有液相凝胶色谱。 5、电色谱法：利用带电物质在电场作用下移动速度不同进行分离的色谱法。,三、色谱分离过程,以分离A、B两组分的气-固吸附色谱为例： 1、当试样由载气携带进入色谱柱与固定相接触时，被固定相吸附；,色谱分离过程,2、随着流动相的不断流入，被吸

7、附的组分又从固定相中脱附； 3、脱附的组分随着载气向前移动时又再次被固定相吸附。 4、随着载气的流动，吸附、脱附的过程反复地进行。,在这个过程中，各组分与固定相间的吸附作用不同，因而吸附与脱附的速度和次序不同而产生微小的分离，随着载气的流动，吸附与脱附的过程反复进行，微小的分离被多次累加，最终达到分离。,四、色谱法的特点,色谱法是以其优越的分离能力为特点，它的分离效率远远高于其他分离技术如蒸馏、萃取、离心等方法。 （1）分离效率高：复杂混合物，有机同系物、异构体、手性异构体。 （2）灵敏度高：可以检测出g.g-1(10-6)级甚至ng.g-1(10-9)级的物质量。 （3）分析速度快：一般在几

8、分钟或几十分钟内可以完成一个复杂试样的分析。 （4）样品用量少：用极少的样品就可以完成一次分离和测定。,（5）应用范围广：它几乎可用于所有化合物的分离和测定，无论是有机物、无机物、低分子或高分子化合物，甚至有生物活性的生物大分子也可以进行分离和测定。 气相色谱：沸点低于400的各种有机或无机试样的分析。 液相色谱：高沸点、热不稳定、生物试样的分离分析。 （6）操作简便：分离和测定一次完成，可以和多种分析仪器联用，易于自动化，可在工业流程中使用。 不足之处：被分离组分的定性较为困难。,第二节 色谱法基本术语,一、色谱流出曲线 试样中各组分经色谱柱分离后，按先后次序经过检测器，检测器将流动相中各组

9、分浓度（或含量）的变化转变为相应的电信号，由记录仪所记录下信号-时间曲线或信号-流动相体积曲线，称为色谱流出曲线，又称色谱图。,在色谱流出曲线上，检测器检测到的待测组分的浓度（或含量）表现为峰状，称为色谱峰，每一分离出的组分表现为一个色谱峰。,图中的1、2即为两个色谱锋。,二、色谱参数和术语,1、基线 当没有试样组分而仅有流动相进入色谱柱时，在实验操作条件下，反映检测器系统噪声随时间变化的线称为基线。 稳定的基线应是一条直线，所以基线的平直与否可反映出仪器及实验条件的稳定情况。,图中的OQ即为流出曲线的基线,2、峰高(h)和峰面积(A),峰高是指色谱峰顶点到基线的垂直距离，以h表示。 峰面积是

10、指色谱峰曲线与峰底基线所围成区域的面积，以A表示。 意义：峰高或峰面积的大小和每个组分在样品中的含量相关，因此色谱峰的峰高或峰面积是色谱法进行定量分析的主要依据。,3、保留值,保留值表示试样中各组分在色谱柱中的滞留时间，通常用时间（也可用将组分带出色谱柱所需载气的体积）来表示。 在一定的实验条件下，任何一种物质都有一定的保留值。保留值是色谱定性分析的依据。,（1）用时间来表示保留值,死时间（tM）：不与固定相作用的物质（如空气）从进样到出现峰极大值时的时间，它与色谱柱的空隙体积有关。由于该物质不与固定相作用，因此，其流速与流动相的流速相近。,保留时间（tR）：,试样中某组分的保留时间指从进样到

11、出现其色谱峰极大值时的时间。它包括组分随流动相通过柱子的时间tM和组分在固定相中滞留的时间tR。tR可作为色谱锋位置的标志。,调整保留时间（tR）：,扣除了死时间的保留时间，即组分在固定相上滞留的时间。 tR = tR -tM tR反映了被分析的组分因与色谱柱中固定相发生相互作用，而在色谱柱中滞留的时间，它更确切地表达了被分析组分的保留特性，因而是色谱定性分析的基本参数。,（2）用流动相的体积来表示保留值,保留时间受流动相流速的影响，为了消除这一影响，保留值也可以用从进样开始到出现峰极大值所流过的流动相体积来表示，即用保留时间乘以流动相平均流速。 设流动相流速为FC，则 死体积（VM）： VM

12、 = tM FC 保留体积（VR）： VR = tR FC 调整保留体积（VR）：VR=VR-VM=tRFC,（3）相对保留值,相对保留值（21）：在一定的实验条件下，组分2与另一组分1的调整保留时间之比。 即 21仅与柱温和固定相性质有关，而与其他操作条件无关，它表示了固定相对这两种组分的选择性。 只要柱温、固定相不变，即使柱长、柱内径、填充情况及流动相流速有变化，21仍保持不变。,4、色谱峰的区域宽度,色谱峰的区域宽度是色谱流出曲线的重要参数之一，可用于衡量色谱柱的柱效及反映色谱操作条件下的动力学因素。宽度越窄，其效率越高，分离的效果也越好。 区域宽度通常有三种表示方法： 标准偏差 半峰宽

13、W1/2 峰底宽Wb,标准偏差：峰高0.607倍处峰宽的一半。 半峰宽W1/2：峰高一半处的峰宽。 W1/2=2. 354。 峰底宽Wb：色谱峰两侧拐点上切线与基线的交点间的距离。Wb=4。 峰拐点：在组分流出曲线上二阶导数等于零的点，称为峰拐点，如图中的E点与F点。,5、分配系数,如前所述，色谱分离的实质是基于样品组分在固定相和流动相之间反复多次的分配平衡。这种分离过程经常用样品组分的分子在两相间的分配来描述，而描述这种分配的参数称为分配系数(K)，即在一定温度下，组分在两相之间分配达到平衡时的浓度比。 当K=1时，组分在固定相和流动相中浓度相等。 当K1时，组分在固定相中的浓度大于在流动相

14、中的浓度。 当K1时，组分在固定相中的浓度小于在流动相中的浓度。,意义：分配系数是色谱分离的基本参数之一，实际工作中常应用分配系数K来表征色谱分配过程。 色谱柱中不同组分能够分离的先决条件是其分配系数不同。分配系数小的组分，在固定相中停留时间短，较早流出色谱柱；分配系数大的组分，在流动相中的浓度较小，移动速度慢，在柱中停留时间长，较迟流出色谱柱；两组分分配系数相差越大，两峰分离得就越好。 分配系数K是由组分的性质及固定相的热力学性质决定的，随柱温及柱压变化，与柱中两相的体积无关。,6、分离度,同时反映色谱柱效能和选择性的一个综合指标，也称总分离效能指标或分辨率。 定义为：相邻两组分色谱峰保留值

15、之差与两个组分色谱峰峰底宽度总和之半的比值。 式中，R=0.8，两峰的分离程度可达89%； R=1.0，分离程度达98%； R=1.5，分离程度达99.7%，是相邻两峰完全分离的标准。,讨论：,色谱分离中的四种情况的讨论：,柱效、分配系数与分离效果的关系： 柱效较高，K(分配系数差)较大，完全分离； K不是很大，柱效较高，峰较窄，基本上完全分离； 柱效较低，K较大，但分离的不好； K小，柱效低，分离效果更差。,小结：色谱流出曲线的意义 色谱峰数=样品中单组份的最少个数； 色谱保留值定性依据； 色谱峰高或面积定量依据； 色谱保留值或区域宽度色谱柱分离效能评价指标； 色谱峰间距固定相或流动相选择是

16、否合适的依据。,第三节 色谱法基本理论,一、塔板理论 二、速率理论,色谱理论,色谱理论需要解决的问题：色谱分离过程的热力学和动力学问题。影响分离及柱效的因素与提高柱效的途径，柱效与分离度的评价指标及其关系。,组分保留时间为何不同？色谱峰为何变宽？ 组分保留时间：色谱过程的热力学因素控制； （组分和固定液的结构和性质） 色谱峰变宽：色谱过程的动力学因素控制； （两相中的运动阻力，扩散） 两种色谱理论：塔板理论和速率理论；,塔板理论的假设： （1）在每一个平衡过程间隔内，平衡可以迅速达到； （2）将流动相看作成脉动（间歇）过程； （3）试样沿色谱柱方向的扩散可忽略； （4）每次分配的分配系数相同。

17、,一、塔板理论-柱分离效能指标,1.塔板理论（plate theory） 半经验理论： 将色谱分离过程比拟作蒸馏过程，将连续的色谱分离过程分割成多次的平衡过程的重复 （类似于蒸馏塔塔板上的平衡过程）；,色谱柱长：L， 虚拟的塔板间距离：H， 色谱柱的理论塔板数：n， 则三者的关系为： n = L / H 理论塔板数与色谱参数之间的关系为（经验公式）：,保留时间包含死时间，在死时间内不参与分配!,2.有效塔板数和有效塔板高度,单位柱长的塔板数越多，表明柱效越高。 用不同物质计算可得到不同的理论塔板数。 组分在tM时间内不参与柱内分配。需引入有效塔板数和有效塔板高度：,3.塔板理论的特点和不足,特

18、点: （1）当色谱柱长度一定时，塔板数 n 越大(塔板高度 H 越小)，被测组分在柱内被分配的次数越多，柱效能则越高，所得色谱峰越窄。 （2）不同物质在同一色谱柱上的分配系数不同，用有效塔板数和有效塔板高度作为衡量柱效能的指标时，应指明测定物质。,不足: （1）柱效不能表示被分离组分的实际分离效果，当两组分的分配系数K相同时，无论该色谱柱的塔板数多大，都无法分离。 （2）塔板理论无法解释同一色谱柱在不同的载气流速下柱效不同的实验结果，也无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径。,二、 速率理论-影响柱效的因素,速率理论是在继承塔板理论的基础上发展起来的。它阐明了影响色谱峰变宽的物理化学因素，并指

19、明了提高和改进色谱柱效能的方向，对毛细管柱色谱和高效液相色谱的发展起着指导性的作用。 该理论用速率理论方程式（范特姆特方程式）阐明影响理论塔板高度即柱效能的因素。,1、速率方程（也称范.弟姆特方程式） H = A + B/u + Cu H：理论塔板高度， u：载气的线速度(cm/s) 上式表明： 减小A、B、C三项可提高柱效； 存在着最佳流速。 A、B、C三项各与哪些因素有关？,A涡流扩散项,由于组分分子与柱内填充颗粒发生碰撞，形成流动相紊流，引起谱峰变宽，使柱效降低。,固定相颗粒越小dp，填充的越均匀，A，H，柱效n。表现在涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻，色谱峰较窄。,A = 2dp d

20、p：固定相的平均颗粒直径 ：固定相的填充不均匀因子,B/u 分子扩散项,由于柱内存在着浓度梯度，组分分子由高浓度处向低浓度处扩散，方向与流动相运动方向一致，从而使谱峰扩张，H(n)，分离变差 。 分子扩散项与流速有关，流速，滞留时间，扩散; 与流动相的摩尔质量有关，M载气，扩散。 因此，加快流动相的流速、使用摩尔质量大的流动相，可以减少分子扩散。,C u 传质阻力项,两相间的传质阻力使柱横断上的浓度分配不均匀，引起峰扩张。改善两相间传质可削弱传质阻力的影响。减小担体粒度，选择小分子量的气体作载气，可降低传质阻力。,2、速率理论的要点,（1）组分分子在柱内运行的多路径与涡流扩散、浓度梯度所造成的分子扩散及传质阻力使气液两相间的分配平衡不能瞬间达到等因素是造成色谱峰扩展、柱效下降的主要原因。 （2）通过选择适当的固定相粒度、载气种类、液膜厚度及载气流速可提高柱效。 （3）速率理论为色谱分离和操作条件选择提供了理论指导。阐明了流速和柱温对柱效及分离的影响。,（4）各种因素相互制约，如载气流速增大，分子扩散项的影响减小，使柱效提高，但同时传质阻力项的影响增大，又使柱效下降；柱温升高，有利于传质，但又加剧了分子扩散的影响，选择最佳条件，才能使柱效达到最高。,