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1、第3章蛋白质的通性、纯化和表征,一、蛋白质的酸碱性质 1、 蛋白质的两性解离 蛋白质可解离基团有肽链末端-氨基和-羧基；侧链基团；如果是结合蛋白，辅基的可解离基团。主要是R基的基团解离。 蛋白质分子的可解离基团的pKa也可以通过酸碱滴定的方法来求得。,蛋白质等电点定义，用pI 表示。 蛋白质在等电点时的特点 蛋白质的pI可在实验室测得，也与组成蛋白质的氨基酸种类有关。,2、蛋白质的等电点,一、蛋白质的酸碱性质,二、蛋白质的胶体性质 蛋白质胶体溶液稳定的原因： 1）蛋白质颗粒大小：pr颗粒大小恰好适于形成胶体 2）带有电荷：在非pI的pH条件下，由于同种Pr颗粒表面带有相同电荷。 3）形成水化膜
2、：由于Pr分子表面分布许多带电基团和极性基团，它们对水有高度亲和力，在水溶液中会把水分子吸附在分子的表面形成一层较厚的水化膜。,三、 蛋白质的沉淀反应 可逆性沉淀：沉淀的蛋白质，内部结构基本上没发生变化，仍保持原有生物学功能，消除沉淀或降低沉淀因素后蛋白质仍会溶解在原来的溶液中。 不可逆沉淀：沉淀出的蛋白质内部结构发生了变化，失去了生物学功能，消除沉淀因素后，不会溶解 盐析法：向Pr溶液加大量高浓度中性盐(硫酸铵、硫酸钠、氯化钠）能使蛋白质沉淀析出。蛋白质的分段盐析。 盐溶:在盐浓度很稀时,随着盐浓度的增高,球状蛋白质的溶解度增高。,2、有机溶剂沉淀法： 与水互溶的有机溶剂（极性有机溶剂如甲醇
3、、乙醇、丙酮等 ）能使蛋白质在水中的溶解度降低而沉淀析出。 有机溶剂能引起蛋白质沉淀主要原因是：加入有机溶剂会降低溶液的介电常数；溶质分子间的作用增加会使蛋白质分子表面可解离基团的离子化程度减弱，水化程度降低，引起蛋白质脱去水化层。 用酒精沉淀蛋白质时低温快速沉淀的蛋白质不变性，属可逆沉淀，室温下用酒精沉淀蛋白质属不可逆沉淀。,三、 蛋白质的沉淀反应,3. 重金属盐沉淀法：当溶液的PHPI时，Pr颗粒带负电荷，它容易与重金属盐（氯化高汞、硝酸银、醋酸铅等）中的重金属离子（Hg2+、Cu2+、Ag2+）结合成不溶性盐而沉淀。 4. 生物碱试剂和某些酸类沉淀法： 单宁酸、苦味酸、钼酸、钨酸、能沉淀
4、蛋白质的生物碱，称为生物碱试剂以及某些酸（如：三氯乙酸、水杨酸和硝酸）也能沉淀蛋白质。 蛋白质的相互沉淀作用,三、 蛋白质的沉淀反应,OH,N,四、 蛋白质的颜色反应,五、蛋白质分离纯化的一般原则 分离纯化蛋白质一般经过：前处理、粗分级分离和细分级分离。 1、前处理： 破碎生物组织； 选择合适的缓冲液把蛋白质提取出来； 如果所要的蛋白质主要集中在细胞的某一组分中，如细胞核、染色体、核糖体，则可用差速离心法进行分离。 2、粗分级分离：采用的方法有分段盐析法；等电点沉淀法和有机溶剂分级分离法等。 3、细分级分离：采用的方法一般有层析法；凝胶过滤法；离子交换层析法；吸附层析和亲和层析，必要时选择电泳
5、法作进一步纯化。,利用对配体的特异生物学亲合力纯化亲和层析,六、蛋白质分离纯化的方法,七、蛋白质相对分子质量的测定 凝胶过滤法 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法 沉降速度法,八、蛋白质的含量测定和纯度鉴定 蛋白质含量测定:凯氏定氮法、双缩脲法、Folin-酚试剂法（又叫Lowry)，紫外吸收法、染料结合法（考马斯亮蓝结合法，也叫Bradford法）和胶体金测定法等。 蛋白质纯度的鉴定:凯氏定氮法、双缩脲法、Folin-酚试剂法（又叫Lowry)，紫外吸收法、染料结合法（考马斯亮蓝结合法，也叫Bradford法）和胶体金测定法等。,1、概念：天然蛋白质受物理或化学因素的影响使次级键断裂，天然构象改变
6、，导致生物学活性丧失，理化特性改变，但其共价键不变，这种现象称为蛋白质的变性。发生变性的蛋白质叫变性蛋白。 2、变性因素：化学因素：强酸、强碱、尿素、胍、去污剂、重金属盐、苦味酸、浓乙醇；物理因素：加热、剧烈振荡、搅拌、紫外线、超声波。,3、变性特点及表现：变性蛋白主要特点。 1.首先丧失生物学活性（如，酶失去催化能力，） 2.理化性质改变，蛋白变性后，疏水基团外露，溶解度降低，易沉淀析出；结晶能力丧失；分子形状改变，球蛋白变成松散结构，既肽链松散，反应基团（如：SH）增加，易被水解酶消化；黏度增加。 .一级结构没破坏，高级结构破坏。组分及分子量未变,九、蛋白质的变性,4、可逆变性和不可逆变性： 可逆变性：变性初期，Pr分子构象未深度破坏，当除去变性因素后，还可以恢复原来构象，表现出生物活性，这种变性叫可逆变性。 不可逆变性：Pr分子构象被彻底破坏，当除去变性因素后，也不能恢复原来构象，使生物活性彻底丧失，这种变性叫不可逆变性，多数蛋白质的变性属不可逆变性。 变性蛋白质分子互相凝集为固体的现象称凝固。如煮鸡蛋、做豆腐。,