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1、第四章 谷氨酸生产菌的主要特征、育种及其扩大培养,第一节 谷氨酸产生菌的主要特征 第二节 谷氨酸产生菌在发酵过程中的形态变化 第三节 谷氨酸产生菌的育种 第四节 菌种的扩大培养及其影响因素,第一节 谷氨酸产生菌的主要特征和性质,一、现有谷氨酸生产菌的分类,棒状杆菌,小杆菌属,杆菌Bacillus ，细胞呈杆状或圆柱形，一般其粗细（直径）比较稳定，而长度则常因培养时间、培养条件不同而有较大变化。,（1）细胞形态为球形、棒形至短杆形； （2）革兰氏染色阳性，无芽孢，无鞭毛，不能运动； （3）是需氧型微生物； （4）脲酶强阳性； （5）不分解淀粉、纤维素、油脂、酪蛋白及明胶等； （6）发酵过程中菌体
2、发生明显的形态变化，同时发生细胞膜通透性的改变； （7） CO2固定反应酶活力强； （8）异柠檬酸裂解酶活力欠缺或微弱，乙醛酸循环弱；,二、生物素缺陷型菌株的主要特征,（9） -酮戊二酸氧化能力缺失或微弱； （10）还原型辅酶（NADPH2）进入呼吸链能力弱； （11）柠檬酸合成酶、乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶以及谷氨酸脱氢酶活力强； （12）具有向环境中渗透谷氨酸的能力； （13）不分解利用谷氨酸，并能耐高浓度的谷氨酸。,第二节 谷氨酸产生菌在发酵过程中的形态变化,一、种子的菌体形态,二、谷氨酸发酵不同阶段的菌体形态,三、谷氨酸发酵感染噬菌体后的菌体形态,1.发酵前期感染噬菌体的菌体形态,细胞数
3、量明显减少，细胞不规则，发圆，发胖，有明显的细胞碎片，严重时出现拉丝、拉网。,生产上表现为排气口二氧化碳迅速下降，OD值下跌，耗糖缓慢等。,2.发酵中后期感染噬菌体的菌体形态,细胞形态不规则，边缘不整齐，有的边缘似乎有毛刺状的东西，有细胞碎片。,生产上的表现： OD值下降，泡沫多，黏度大，耗糖缓慢。,及时补充营养物，大多可完成发酵。,第三节 谷氨酸产生菌的育种,一、日常菌种管理育种工作,1.定期分纯 一般1-2个月分纯一次，把产酸高、生长快、无噬菌体感染的菌株挑选出来。,2.高产菌制作安瓿管 防止菌种变异。,二、选育耐高渗透压的菌种 三、选育不分解利用谷氨酸的突变株 四、选育细胞膜通透性好的突
4、变株,第四节 菌种的扩大培养及其影响因素,一、菌种保藏的方法,斜面保藏法,穿刺保藏法,液氮罐,二、种子扩大培养的目的,1.种子扩大培养：是指将处于休眠状态的保藏菌种接入试管斜面活化后，再经过摇瓶、种子罐等逐级扩大培养，从而获得一定数量和质量的纯种的过程。,2.做为种子必须具备的条件是： 无杂菌污染； 生理状态稳定，保持稳定的生产性能； 活力旺盛，移接至发酵罐后能够迅速生长； 菌体总量能够满足发酵罐所需的接种量。,3.种子扩大培养的目的：,（1）为发酵罐提供纯而壮、代谢旺盛的种子； （2）为发酵罐提供足够数量的种子。,三、种子扩大培养的过程,1.流程,保藏菌种,斜面活化,摇瓶培养,种子罐培养,发
5、酵罐,2.斜面菌种的培养,（1）对斜面培养基的要求,有利于菌种的生长，不产酸；培养基配方以多含有机氮而不含或少含糖为原则。,（2）培养基组成,葡萄糖0.1%，蛋白胨1.0%，牛肉膏1.0%，酵母膏0.5%，氯化钠0.25%，琼脂2.0%，pH7.07.2（传代和保藏斜面不加葡萄糖）。,3.一级种子培养,（1） 培养基组成 葡萄糖2.5，尿素0.5，硫酸镁0.04，磷酸二氢钾0.12，玉米浆2.53.5(根据玉米浆质量指标增减用量)，硫酸亚铁、硫酸锰各22mg/kg，pH7.0。 （2）培养条件 每个1000mL三角瓶分装培养基200mL，灭菌，冷却后接入斜面菌种，置于冲程7.6cm左右、频率9
6、6 次min左右的往复式摇床上恒温振荡培养10 12h。 温度3233。,（3）一级种子的要求,种龄： 12h pH： 6.40.1 光密度： OD值净增0.5以上 残糖： 0.5%以下 噬菌体检查：无 镜检： 菌体生长均匀、粗壮，排列整齐 革兰氏染色： 阳性,4.二级种子培养,（1）培养基组成 实例一：葡萄糖25gL，MgSO47H2O 0.7gL，KH2PO4 1.5gL，糖蜜125gL，玉米浆250gL，纯生物素18.8gL，尿素5gL，FeSO4、MnSO4各2mgL，pH7.0，实消，121保温10min。 实例二：葡萄糖45gL，MgSO47H2O 0.7gL，KH2PO4 1.5
7、gL，糖蜜125gL，玉米浆250gL，纯生物素18.8 gL，FeSO4、MnSO4各2mgL，实消，121保温10min，实消前不需调节pH，实消降温后用液氨调节至pH7.0。,接种量：0.81.0% 培养温度：32 培养时间：78h,（2）培养条件,空消压力0.2MPa，计时50min，温度130 实消温度118 ，计时5min 工艺控制：,（3）培养操作规程,通风比1：0.2； 温度33 33.5； 罐压0.1MPa,（4）二级种子的质量要求,种龄： 78h pH： 7.2 光密度： OD值净增0.5以上 残糖： 消耗 1%左右 噬菌体检查：无 镜检： 菌体生长旺盛，排列整齐 革兰氏染色： 阳性,三、影响种子质量的主要因素,1.培养基构成,斜面培养基含糖低，二级种子培养基尽量接近发酵培养基。,2.温度,种子培养要选择最适温度。因为幼龄菌对温度变化敏感。,3.pH,要比较稳定。,4.溶解氧,不同时期需氧量不同，区别控制。,5.接种量,名词：接种量,接种量的大小与该菌在发酵罐中生长繁殖的速度有关。,趋势：生产上多以大接种量和丰富培养基作为高产措施。,6.种龄,名词：种龄,对接种种龄的控制非常重要。 一般种子培养时间以78h为好。,