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1、 收稿日期 ? 2005- 05- 16 基金项目 ? 江西省教育厅科技计划项目( 赣教技字 2005 166号) 和南昌大学食品科 学教育部重点实验室开放基金资助项目( NCU 200408) 作者简介 ? 颜流水( 1964- ) , 男, 理学博士, 教授。研究方向: 环境与生物医药分析及仪器。 现代微分离新技术及在环境与生物医药分析中的应用 颜流水1, 丁军军1, 汪月华1, 黄智敏1, 万益群2 ( 1. 南昌航空工业学院环境与化学工程系, 江西 南昌? 330034; 2. 南昌大学分析测试中心, 江西 南昌? 330047) 关键词 ? 微分离; 微流控芯片; 质谱联用; 环境分
2、析 摘? 要 ? 分离科学面临的最大挑战是复杂体系中痕量组分的分离分析。为适应复杂体系分析, 现代微分离技术成为化学 化工和生命科学的研究热点。本文介绍了近五年来现代微分离分析中新技术, 包括毛细管电泳、 毛细管电色谱、 微流控芯片 和质谱联用技术; 重点综述了这些新技术在环境与生物医药分析中的应用; 最后概述了微分离分析技术的发展前景。 中图分类号 ? O657. 32? ? ? 文献标识码 ? A? ? ? 文章编号 ? 1001- 4926(2005) 02- 0001- 06 New technologies on modern micro- separation and their
3、application in environmental and biomedicine analysis YAN Liu- shui1, DING Jun- jun1, WANG Yue- hua1, HUANG Zhi- min1, WAN Yi- qun2 ( 1. Department o f Environmental and Chemical Engineering , Nanchang Institute o f Aeronautical Technology , Nanchang, Jiangxi ? 330034; 2. Analytical and Testing Cent
4、er, Nanchang University, Nanchang, Jiangxi ? 330047) Key words:micro- separation; microfluidic chip; hyphenation of mass spectrometry; environmental analysis Abstract: Separation and analysis of trace components in sophisticated matrices is the most severe challenge which separation science encoun?
5、ters. As a result, modern micro- separation technology has become the research hotspot in chemistry, chemical engineering and life science. In this paper, the new technologies onmodern micro- separation and their development in the latest 5 years, including capillary electrophore? sis, capillary ele
6、ctrochromatography, microfluidic chip and hyphenation of mass spectrometry, were introduced. The recent application of these new technologies in environmental and biomedicine analysiswas reviewed. Its development prospect inthese fieldswas briefly outlined (with48 references) . 随着生命科学的迅速发展, 医药和环境与生物
7、相互作用的研究日益被重视。然而, 这种相互作用往往是 基于组成复杂、 成分微量或痕量的体系中。要深入探索和了解这些相互作用的规律, 需要分辨率强、 检测灵 敏度高和分析速度快的分析方法, 许多常规的分析技术已不能信任。以毛细管电泳、 色谱学为主要内容的现 代分离分析技术极大推动了复杂体系中这些相互作用的研究。本文介绍近五年来毛细管电泳、 液相色谱分 析研究中新技术以及在生物医药与环境分析中新应用。 1 ? 毛细管电泳分析 毛细管电泳( Capillary electrophoresis, CE) 也称高效毛细管电泳( HPCE) , 是从传统电泳发展而来的, 它以 高压( 可达 30 kv)
8、下产生的强电场为驱动力, 以小内径的石英毛细管( 常用 20- 100 ? m, 有效长度 50- 75 cm) 为分离通道, 依据各组分之间电泳淌度或分配系数的差异实现分离。上世纪 90 年代以来, 随着毛细管电泳 商品仪器的出现, 毛细管电泳方法得到快速发展, 该方法具有分离效率高、 快速、 样品用量少、 灵敏度高和应 用范围广等特点。 2005 年 6 月 第 19 卷? 第 2期 南昌航空工业学院学报(自然科学版) Journal of Nanchang Institute of Aeronautical Technology(Natural Science) Jun. , 2005
9、Vol. 19? No. 2 毛细管电泳和激光诱导荧光技术的联用已经实现了单分子水平的检测, 其检出限可达10- 12mol/ L。Lil? lard 1等建立利用毛细管电泳和激光诱导荧光分析单细胞的装置, 分离了细胞内血红蛋白和碳酸酐酶, 每一 次分析过程( 包括进样、 细胞溶解、 分离和检测) 仅需 4 分钟。这种单细胞分析技术的出现, 使得单个细胞中 表达蛋白的测量成为当今毛细管电泳研究的热点, 毛细管电泳有可能成为探索功能细胞纳米世界的重要工 具2。 氨基酸分子与生命过程密切相关, 它一直是毛细管电泳研究的重要对象。利用毛细管电泳和激光诱导 荧光检测, 可以方便地检测生物组织和体液样品
10、中与疾病密切相关的某些生理活性氨基酸成分, 有助于探索 疾病的发展机制3- 5。毛细管电泳在药物质量控制和中药及复方制剂化学成分的分离分析中将不断发挥重 要作用6- 7。作者建立了以 ? - 环糊精为手性选择剂的毛细管电泳方法, 使抗老年性痴呆症药物加兰他敏 的原料样中十种结构相似化合物获得快速基线分离, 并对其中非药效成分 R 型异构体进行定量测定, 该法 在灵敏度和线性范围方面均优于文献报道的高效液相色谱法和紫外分光光度法8。毛细管电泳也已用于包 括生物碱、 黄酮、 苷类、 酚类、 醌类和有机酸等9等中药活性成分分析。 激光诱导荧光检测虽然灵敏度很高, 但它通常需要预先将被分析对象进行衍生
11、化, 引入能发强荧光的基 团, 使用范围受到限制。因此, 在毛细管电泳应用于复杂体系中痕量组分的分离分析中, 最迫切需要克服的 障碍是提高检测灵敏度。近年来, 在毛细管电泳在线和离线富集方面已取得可喜进展, 其中由日本学者 Ter? abe 提出的在线堆扫( Sweeping) 技术因其操作简便、 富集效果好而越来越受到人们的重视, 具有广泛的应用 前景。在在线 Sweeping 技术中, 一般用十二烷基磺酸钠( SDS) 作为背景胶束相, 由于 SDS 带负电, 在电场中 向正极移动, 当 SDS 穿过不含胶束的样品带时, 由于样品与胶束的相互作用, 样品会随 SDS 一起向正极移 动, 使
12、样品带压缩从而实现富集10, 5000 倍的富集倍数已有报道11, 该技术适于中性和带电物质的富集。I? garashi12利用全氟代表面活性剂通过离线液- 液萃取和在线 Sweeping 技术两种富集方法联合, 获得了高达 125, 000 的浓集倍数, 可用于分离检测天然水体中五种痕量的多环芳烃。金琦芸13等建立了用固相萃取高 效毛细管电泳同时分析尿中 20种碱性药物与毒物的方法, 最低检测限为 15- 80 ? g L- 1, 可用于多种类别的 药物与毒物分析。Shakulashvili 14等利用 Lichrolut EN 和Lichrolut RP- C18 固相萃取柱富集、 胶束毛
13、细管电泳 分离和紫外检测成功测定了河水和自来水中氯代酸、 苯基脲、 磺酰脲、 三嗪四类共 25 种农药的残留量, 固相 萃取可获得 5000 的富集倍数, 经富集后各种不同农药的检测限为 0. 04 - 0. 1 ? g L- 1, 可满足最大残留允许 量检测的要求。 2 ? 毛细管电色谱分析 毛细管电色谱法( Capillary electrochromatography, CEC) 是在毛细管中填充或在毛细管壁涂布、 键合色谱固 定相, 用电渗流或电渗流结合压力流来推动流动相的一种液相色谱法, 是高效液相色谱法和高效毛细管电泳 的有机结合。它不仅克服了液相色谱中压力流本身流速不均匀引起的峰
14、扩展, 而且柱内无压降, 使峰扩展只 与溶质扩散系数有关, 从而获得了接近于毛细管电泳水平的高柱效, 同时还具备了液相色谱的选择性。该领 域在上世纪90 年代后期已成为毛细管电泳和色谱的研究热点, 尤其在电色谱柱技术 15方面发展迅速, 在生 物医药与环境分析等领域具有广泛的应用前景16- 18。 毛细管电色谱从固定相存在的方式来看, 可分为填充柱、 开管柱和连续床层三类。填充柱毛细管电色谱 是最常用的一种模式, 一般是在毛细管内填充硅基微粒, 大多数用3? m 十八烷基硅胶 ( ODS 或C18) 微珠, 分 离效率在 91000? 400000 塔板数/ 米。此外, 使用的填料还有无孔 O
15、DS、 硅胶、 键合型硅胶、 聚苯乙烯 ? 二乙 烯基苯固定相和手性固定相等。毛细管电色谱填充柱品种较多、 商品化易得、 柱效高, 其缺点是因需要填充、 封口, 导致在使用中易产生气泡、 易断和填充不均匀等问题。 开管柱的制备方法主要有涂布、 键合和溶胶- 凝胶法。涂布法制备过程较简单。先将熔硅毛细管在高 温和气流条件下处理, 然后通过静态法使待涂布的溶液在毛细管内壁形成薄膜, 最后将其固载化; 键合法制 备开管柱时, 通常先对柱内壁进行蚀刻, 再键合上相应的固定相。该方法可有效地提高相比, 增加溶质和固 定相间的相互作用, 不足是制备过程较复杂、 耗时长; 溶胶- 凝胶法制备开管柱是通过溶胶
16、- 凝胶技术在毛 2 南昌航空工业学院学报(自然科学版) 细管内壁形成一层含官能团的多孔硅玻璃膜, 将固定相直接嵌入玻璃介质中, 在制备过程中多孔介质和固定 相在一步同时完成。开口管毛细管柱可避免填充柱的主要技术问题, 但样品容量低, 使检测度低。 连续床层毛细管电色谱是通过原位聚合或溶胶- 凝胶在毛细管中形成连续、 整体、 多孔的固定床层的一 种电色谱模式。按制备方法可以分为三类: 聚合物连续床层电色谱柱、 二氧化硅连续床层电色谱柱和以填充 柱为基础的连续床层电色谱柱。聚合物连续床电色谱柱的制备, 通常是先配置单体、 交联剂、 致孔剂、 电渗流 产生剂、 引发剂等化合物的混合溶液, 再将溶液
17、注入毛细管中, 在适当条件下反应形成聚合物连续床层19; 二氧化硅连续床电色谱柱是通过烷氧基硅烷酸催化水解和凝固以及烷氧基氯硅烷柱后衍生制得; 以填充柱 为基础的连续床电色谱柱的制备, 是先将填料填充到毛细管中, 再通过溶胶- 凝胶技术或硅胶固定相高温熔 融和柱后衍生形成连续床电色谱柱。连续床毛细管电色谱柱的分离效率很大程度取决于整型聚合物的孔 隙, 而其微孔性质可通过改变反应溶剂或表面活性剂的比例来调节。连续床毛细管电色谱模式不仅避免了 填充柱中的填充、 封口问题, 同时又可以克服开管柱相比小的不足。这种整体柱的最大特点是在聚合过程中 容易进行化学修饰, 在聚合物中引入不同功能的基团, 能够
18、方便地对聚合物的疏水性、 刚性、 孔径性质和电渗 流性质等进行调节, 在蛋白质、 多肽和核苷酸分离中具有重要作用。为了提高整体柱的选择性, 运用分子印 迹技术和原位聚合, 能够制备出对特定目标分子具有预定选择性的分子印迹连续床整体式毛细管柱, 可用于 复杂体系中某个特定组分的快速筛选和高效富集20- 21。 为了增大分离容量和节省分离时间, 复杂组分的样品分离往往需要增加液体压力和溶剂的梯度洗脱。 将外加液体驱动和溶剂梯度洗脱与毛细管电色谱相结合形成的加压梯度毛细管电色谱是一项新技术22。 罗国安等开发了可用于梯度洗脱的多功能毛细管电色谱仪, 同时分离了大黄片提取液中五种蒽醌类活性成 分, 获
19、得的分离效果和分离速度均优于常规的液相色谱法和毛细管电泳法23。利用该技术还成功分离了十 八种氨基酸和 pBR 322DNA/Hinf I 中所有的 10个 DNA 片段 24- 25。 3 ? 微流控芯片分析 毛细管电泳和毛细管电色谱的一个重要发展趋势是进一步微型化和集成化。1990 年瑞士 Ciba- Geigy 公司的 Manz 与Widmer 首次提出了微全分析系统(Miniaturized or Microscale Total Analysis Systems, ?- TAS) 的 概念。微流控芯片分析以毛细管电泳为核心技术, 以芯片为操作平台, 是当前微全分析系统领域发展的重 点
20、26- 27。它的目标是把整个化验室的功能, 包括采样、 稀释、 加试剂、 反应、 分离、 检测等集成在微芯片上, 且可以多次使用。由于具有液体流动可控、 消耗试样和试剂极少、 分析速度成十倍上百倍地提高等特点, 它 可以在几分钟甚至更短的时间内进行上百个样品的同时分析, 并且可以在线实现样品的预处理及分析全过 程。我国于2002 年正式启动了微流控分析系统领域研究, 国家自然科学基金 十五!重大基础研究项目 微 流控生化分析系统的基础研究!和国家 863计划 兴奋剂检测微流控生物芯片!的相继启动, 清华大学、 南京 大学、 浙江大学、 复旦大学、 武汉大学、 长春应化所、 大连化物所等约近
21、20 所国内著名高校和研究所已率先进 入该新技术研究领域, 在连续进样技术、 高分辨芯片分离技术等方面已取得可喜进展。 为了提高芯片的分离柱效和选择性, 近年来不断出现对芯片微孔道修饰、 改性的新方法 28。改性方法 取决于芯片材质。Pumera 等 29先用聚( 氯化二烯丙基二甲基铵) 在玻璃芯片微孔道内壁形成涂层, 然后在涂 层表面吸附稳定的金纳米粒子。通过分离邻氨基苯酚、 间氨基苯酚和对氨基苯酚, 表明金纳米粒子涂层可使 分离度和分离效率成倍提高。Liu 等30提出一种对聚二甲氧基硅烷( PDMS) 芯片微孔道表面改性的连续多 电解质涂层方法。该方法是先在高聚物 PDMS 微孔道表面动态
22、涂覆一层阳离子聚合物 Polybrene ( PB) , 然后 再在该表面涂覆一层阴离子硫酸葡聚糖( DS) , 获得的微孔道在 pH 5. 0- 10. 0 范围内具有稳定的电渗流。而 Regnier 等31提出通过 Ce( IV) 催化 2- 丙烯酰胺- 2- 甲基- 1- 丙磺酸(AMPS) 聚合使 PDMS 通道表面改性 的方法, 实现 5种肽混合物高效芯片电色谱分离, 柱效大于 300, 000 塔板数/ m。Henry 等 32提出一种对有机 玻璃( 聚甲基丙烯酸甲酯, PMMA) 芯片微孔道表面改性的方法。该方法是利用甲酯基团与乙二胺或丙二胺 发生胺解反应, 生成末端胺基化的 P
23、MMA 表面, 呈现反向电渗流。末端胺基化的 PMMA 表面可进一步与异 氰酸十八烷基酯反应, 形成十八烷基改性的表面, 适用于反相电色谱分离。Ngola 等33首次报道通过紫外光 3 第 2期颜流水、 丁军军等: 现代微分离新技术及在环境与生物医药分析中的应用 引发原位聚合, 在玻璃芯片中所有的通道( 25 ? m 深, 50 ? m 宽) 内生成多孔整体聚合物。以此作为芯片电色 谱的固定相, 成功分离并检测了10 种多环芳香烃, 获得的平均理论塔板数为 200, 000 塔板数/ 米。 芯片检测池体积很小, 要求具有高灵敏度的检测方法, 通常多采用激光诱导荧光检测。然而, 激光诱导 荧光检
24、测的样品需要衍生化, 存在费时、 易产生副产物等缺点, 而且难于进一步集成化。近年来, 化学发光 ( Chemiluminescence, CL) 检测因具有灵敏度高、 不需要任何外加光源、 结构简单、 易实现集成等特点, 在实现 芯片化学发光检测金属离子、 氨基酸和某些药物等物质方面已显示良好的应用前景34- 36。 4 ? 质谱联用分析 近年来, 质谱联用分析技术获得很大发展。最成熟的质谱联用是气相色谱- 质谱( GC- MS) 联用技术。 然而, 在药物和环境分析中有相当一部分分析对象是挥发性较小和含羟基或羧基等较强极性的化合物, 采用 GC- MS 测定前必须进行衍生化, 导致试样前处
25、理更加复杂。由于液相色谱- 质谱( LC- MS) 联用法在试样 前处理时勿须进行衍生化, 已成为生物医药分析中不可替代的手段39。液相色谱- 串联质谱( LC- MS- MS) 联用技术, 可以进行两次离子选择作用, 即通过MS l 选择一定质量母离子, 与气体碰撞断裂后, 再经MS2 选择一定质量的子离子, 通常称之为多反应监测( MRM) , 这样大大提高了分析的选择性, 同时也改善了信噪 比。所以,LC- MS- MS 联用技术具有比 GC- MS 和LC- MS 更高的选择性和灵敏度, 特别适合于复杂组分 体系且干扰严重的样品中低含量组分分析测定。 最近, 国际上正在开始将液- 质联
26、用技术应用于水环境中内分泌干扰物等新兴环境污染物的分析研 究38。内分泌干扰化合物( Endocrine disrupter chemicals, EDCs) , 也称环境激素, 是指外源性干扰生物和人体 正常内分泌机能的化学物质。它具有类似雌激素作用, 极其微量便会影响人类以及动物体的内分泌系统, 造 成内分泌失调, 可能阻碍生物体生殖机能或引发恶性肿瘤, 己对人类的持续生存和繁衍构成严重威胁。这些 物质广泛来自农药( 杀虫剂、 除草剂、 杀菌剂) 、 表面活性剂、 增塑剂、 涂料等化工产品和工业原料, 已引起各国 科学家和政府高度重视。内分泌干扰物在环境水中浓度很低, ? g L- 1级甚
27、至是 ng L- 1级浓度, 这给分析技术 提出了很高的要求。液- 质联用技术将发展成为全面调查这类新兴污染物污染状况的一种简便、 快速和可 靠的定性、 定量分析方法。 Mart? nez39等采用液相色谱- 质谱联用方法测定了环境水样、 沉积物和藻类物中 15 种酚类化合物。该 方法的分离是采用 C 18 柱和溶剂梯度洗脱, 检测是采用质谱选择离子监测模式。为了富集和净化样品, 样 品前处理采用了固相萃取( SPE) , 获得的检测限为水样 10- 50 ngL- 1、 沉积物 1- 5 ug kg- 1和藻类物 2. 5- 5 ?g kg- 1。Barcel? 等 40建立了可分析6 种类
28、型共20 种农药的液相色谱- 串联质谱联用方法。该作者采用溶 剂梯度色谱分离, 利用正负两种离子化模式, 在多反应监测条件下质谱检测。该方法具有高度选择性和灵敏 度, 各种组分的线性范围在 1至 1 000 ? gL- 1, 检测限为 0. 010 至 4. 528 ? gL- 1。 任晋等41等用在线固相萃取- 液- 质联用( SPE- LC- MS) 方法分析了饮用水中残留阿特拉津。该方 法仅用45min 就可完成水样中 7 种除草剂( 阿特法津, 西草净, 西码净, 杀草净, 敌稗, 乙草胺, 甲磺隆) 的分 析, 检测限低于欧共体所要求的饮用水标准( 单种农药浓度小于 0. 1 ? g
29、L- 1) , 在线 SPE 的结果重现性和精密 度大大优于液液萃取和离线 SPE, 且环境水样分析时间大大减少。该作者还建立了液相色谱/ 质谱联用分析 环境土样中痕量的莠去津及其脱乙基莠去津( DEA) 、 脱异丙基莠去津( DIA) 和羟基化莠去津( HA) 三种降解 产物的方法42, 通过应用源内离子碰撞诱导解离技术观察母体和其特征碎片离子的情况, 判断痕量降解产 物是否存在, 增加了定性结果的可靠性。 毛细管电泳与质谱联用( CE- MS) 也是近年来一项令人兴奋的技术。它能在高效分离的同时在线提供 化合物的结构信息, 对于分析复杂的生物样品, 是一种非常有价值的分析技术。目前 CE-
30、 MS 中普遍使用的 接口是鞘流接口, 具有制作简单、 可靠、 便于使用等优点。但它的主要缺点是由于鞘流液稀释样品, 使得检测 灵敏度降低。无鞘流液接口具有较高的检测灵敏度。CE- MS 在蛋白质分析、 肽混合物分析和鉴定方面获 得极大重视, 可应用于遗传与代谢疾病快速诊断等临床检验中 43- 44。Soga 等 45采用毛细管电泳- 质谱联 用技术在 17 分钟内同时分离检测了 19 种常见的游离氨基酸, 其中碱性氨基酸的检测限为 0. 3- 1. 1 ? mol 4 南昌航空工业学院学报(自然科学版) L- 1, 酸性氨基酸的检测限小于 6. 0 ? mol L- 1, 该方法的最大优点是
31、不需要衍生化, 简便、 快速和选择性高。 由于质谱可通过选择离子监测模式( SIM) 定量, 能够获得较紫外检测更宽的线性范围和更高的灵敏度, 可以 避免由于实际样品本底复杂而带来的干扰。若采用串联质谱技术, 可以追踪碎片离子的母离子, 从而可对化 合物进行更加确切的指认, CE- MS 在中成药真假鉴别中也得到应用46。 微流控电泳芯片与质谱联用技术正在积极开发中。Kameoka 等49在一种与 PMMA 性能相似的环烯烃聚 合物( Zeonor) 上制作成一个 2 cm 4 cm 的微流控芯片, 芯片内作为电泳分离通道的尺寸为 60 ? m 宽、 20 ? m 深, 分离通道的末端通过一个
32、微型喷嘴与质谱仪相联, 实现质谱检测。该芯片已成功用于分离检测与先天性 心脏病、 肾管疾病等代谢疾病相关的肉碱、 乙酰肉碱和丁酰肉碱三种生物标志物, 仅在 10 s 种内获得基线分 离。因此, 可以预见, 基于质谱检测的电泳微芯片有望开发成为一种应用广泛的快速分子诊断技术48。 综上所述, 近年来现代微分离技术取得许多新进展, 正在朝向高效、 灵敏、 快速、 实用方向发展。在高效 分离方面, 以新型分离介质和分离微通道功能修饰为重点; 在高灵敏检测方面, 以在线或离线富集技术和质 谱联用技术为重点; 在提高分析速度方面, 以样品制备、 分离、 检测等各单元操作集成和芯片化为重点; 在应 用方面
33、, 重点解决生物和环境样品中痕量组分分离测定时复杂基质干扰和多组分同时测定中的问题。所以, 微分离技术是多种高新技术的综合体现, 它必将在生命科学、 环境科学、 化学化工和食品工业等众多领域发 挥更大作用。 参考文献 1 ? Chen S. J. , Lillard S. J. Continuous cell introduction for the analysis of individual cells by capillary electrophoresis J . Anal. Chem. , 2001, 73: 111- 118. 2 ? Woods L. A. , Ewing A.
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