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1、V01272009No4蛋白质组学在肿瘤患者血清标志物研究中的应用刘巍t，廖世奇2，王黎：(1兰州理工大学，甘肃兰州730050；2甘肃省医学科学研究院，甘肃兰州730050)摘要：近几年来随着蛋白质组学研究技术的提高，蛋白质组学被广泛应用于各种疾病研究中，特别是肿瘤标志物方面。肿瘤标志物的研究被广泛应用于无症状的早期患者的筛查，但目前仍有许多影响其临床应用的问题亟待解决，现就目前蛋白质组学在肿瘤标志物方面的应用进行简要综述。关键词：蛋白质组学；疾病；肿瘤标志物中图分类号：057221文献标识码：B文章编号：16711246(2009)04-012104随着大量生物体全基因组序列的获得，特别是
2、人类基因组蛋白质掩盖掉，致使一些低丰度的蛋白质，特别是调控蛋白质序列草图的完成，基因组研究的战略重点不可避免地从结构基和激酶，很难用目前的方法检测到。其次是蛋白质的表达具有因组学转向功能基因组学，丽蛋白质组学正是功能基因组学研时间和空间上的差异性，这也决定了人们很难获得细胞、组织究的重要支柱。过去几年来，蛋白质组学研究在蛋白质表达谱、或生物体的全部蛋白质组成。目前在蛋白质组研究应用中的技翻译后修饰、细胞和亚细胞定位、蛋白质一蛋白质相互作用等方术路线主要是通过双向凝胶电泳建立蛋白质组图谱、用专门的面取得了显著进展，并进入了以大规模发现和鉴定疾病相关的图像扫描分析软件进行图像分析、对感兴趣的蛋白质
3、点进行胰生物标志物和潜在的药物治疗靶标为主要目标的应用研究阶蛋白酶胶上原位消化、通过基质辅助激光解析离子化一飞行时段，蛋白质组学技术也已成为了疾病特异标志物发现研究相关间质谱仪对蛋白质的鉴定、应用生物信息学进行蛋白质结构和实验室的常规工作，特别是在肿瘤患者的前期诊断方面拥有功能的进一步鉴定和分析。巨大潜能。近年来癌症已成为我国城市人口死亡的首要原因，12蛋白质组学的主要技术在农村人口的各项死因中，癌症位于第二位。按目前的医疗水121蛋白质组学的分离技术二维电泳技术目前所应用平，早期癌症患者正规治疗后5年生存率高达7095，而晚的二维电泳体系是由0FarreU等翰于1975年首先提出的。应用期癌
4、症患者治疗后5年生存率只有2030t。在当前肿瘤临该方法可分离肿瘤组织蛋白和正常组织蛋白。它作为一种比较床研究中，由于肿瘤早期不转移，容易切除，可为患者赢得较多成熟的技术已被广泛应用多年，也是目前对蛋白质组分辨率相的存活几率，因此医学科技界对肿瘤的早期诊断格外重视。有对较高、重复性较好的分离技术。其原理是根据蛋白质的两个研究证实肝癌直径与手术后5年生存率密切相关，肿瘤直径也一级属性，即等电点和相对分子质量的特异性，将蛋白质混合cm，5年生存率为100，肿瘤直径每增加1 cm，5年生存率下降物在电荷(采用等电聚焦方式)和相对分子质量(采用SDS20。因此汤钊猷院士把肝癌的早期发现、早期诊断、早期
5、治疗称PAGE方式)两个方向上迸行分离。蛋白质混合物在第一维方向为二级预防，认为是患者获得长期生存的最主要途径脚。因此寻上的分离是利用蛋白质等电点的不同在大孔凝胶中将蛋白质找到一种有效、准确、快速的肿瘤生物标志物意义巨大。理想的分离开，这一过程被称作等电聚焦。蛋白质是两性分子，根据环肿瘤生物标志物必须敏感、特异、微创、可重复性好及患者依从境pH值的不同分别带正电荷、负电荷或零电荷，在pH值高于性好嗍。因此，发现能早期诊断的肿瘤标志物对于提高癌症的治其等电点的位置时，蛋白质带负电，反之带正电。在电场作用疗效果具有重要的意义和广泛的应用前景。目前通过分离肿瘤下，蛋白质分子会分另向正极或负极漂移，当
6、达到与其等电点患者的血清蛋白作为肿瘤标志物进行肿瘤前期诊断具有重要的意义。本文就目前有关蛋白质组学在肿瘤患者血清标志物研究中的应用作简要综述。1蛋白质组学的概念及主要技术11蛋白质组学的概念蛋白质组(prote锄e)是1994年由澳大利亚Macquarie大学的Wilkins Williams提出的，其定义是指一个基因组、一个细胞或组织所表达的全部蛋白质以及它们的表达模式围。蛋白质组研究应用到的分离技术有多种，要想通过一种方法就可以观察到个细胞、个组织或一个生物体中的全部蛋白质几乎是不可能的。其原因首先是因为细胞内蛋白质的表达丰度可能相差6个数量级，高丰度的蛋白质往往在分离鉴定过程中将低丰度相
7、同的pH值位置时，蛋白质不带电，就不再发生漂移。根据此原理，开始的等电聚焦在凝胶中预先由小分子载体两性电解质形成pH值梯度。载体两性电解质是一些可溶性的两性小分子，它们在其pI附近有很高的缓冲能力。当电压加在载体两性电解质混合物之间时，最高pI值的分子(带正电荷最多的分子)移向阴极，最低pI值的分子(带负电荷最多的分子)移向阳极，其余分子将根据其pI值在两个极值之间分散，形成一个连续的pH值梯度；当蛋白质迁移至与其等电点相同的pH值位置时，带电状态达到平衡，不再迁移，结果等电点不同的蛋白质分子得到分离171。蛋白质带电状态取决于其二级结构，因此，没有完全去除二级结构的蛋白质，就可能会产生连续分
8、布的带电状态各异的同一蛋白质的各种构象，从而在二维凝胶电泳(2一DE)胶上产一12】一万方数据生条纹现象而降低分辨率。因此，要达到最大的分辨率，蛋白质必须充分变性，如在9 molL尿素和70 mmolL二硫苏糖醇(聊盯)条件下变性。蛋白质混合物在第二维方向上的分离是按照蛋白质的相对分子质量的大小进行分离。蛋白质是带电的生物大分子，在第二维方向上按其相对分子质量分离时，为了消除电荷的干扰，需要采用SDS对蛋白质进行变性处理。我们在2一DE胶上所看到的是不完整的蛋白质亚基分子，丽SDS是一种强离子去污剂，作为变性剂与助溶性试剂，可以断裂分子内与分子间的氢键或其他非共价键，使分子变性，破坏蛋白质分子
9、的二级结构与三级结构；同时，强还原试剂巯基乙醇和二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，蛋白质分子被解聚成多肽链。解聚后的氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质一SDS胶束，所带的电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷，这就消除了不同蛋白质分子之间原有的电荷差异。因此，这种胶束在SDSPAGE中的电泳迁移率不受蛋白质原有电荷的影响，而主要取决于蛋白质或亚基的相对分子量大小。122蛋白质组学的染色技米二维电泳分离后的蛋白质点经显色后才能被鉴定。二维电泳中的显色是一个重要的步骤，常用的非放射性染色方法中最灵敏的为银染法，其灵敏度可达到l ng甚至更低；其
10、次是荧光染色以及铜染、锌一咪唑负性染色、考马斯亮蓝染色等，后者染色灵敏度为5乱100 ng阚。由于银染凝胶的质谱鉴定较难，附着在凝胶基质上的肽片段胶内提取效率较低，因此大多实验室用银染法寻找差异蛋白质点，再加大上样量，进行考马斯亮蓝染色，结合胶内酶切提取鉴定蛋白质。13蛋白质组学曲其他主要技术131胶上差示电泳(DIGE)技术二维电泳技术上的另个突破是DICE技术，该技术已经被商品化(如安玛西亚公司产品)。DIGE技术使研究者可以全面地观察到两种样品蛋白质表达间的差异。个样品的蛋白质全部用荧光染料(cy3)标记，而对照样品用激发波长不同而化学性质类似的另外一种荧光染料(cy5)标记。两种标记过
11、的样品混合到一起，在同一块胶上进行二维电泳分离。在进行荧光识别时，通过不同波长的扫描，观察个蛋白质点处两种荧光密度的深浅或有无，可以得到有关特定蛋白质点的丰度变化、蛋白质的缺失或是否有新蛋白质出现等信息。DICE技术对于研究对照组和处理组样品的差异蛋白质图谱具有很好的应用前景。DICE技术的优点在于：(1)-q传统的2-DE方法相比，两种样品在同一块胶上分离其重复性大大提高，比较模式简化了；(2)在同一块胶上观察两组蛋白质样品的差异表达更精确直观：通过荧光标记可以很精确地看出蛋白质丰度的改变；(3)荧光染色在4个数量级的范围内可以进行蛋白质点(带)定量，它的动态范围比传统的银染、考马斯亮蓝染色
12、以及胶体考马斯亮蓝染色更宽；(4)所需的染色时间短，标记反应只需要45 rain，比同样检测灵敏度的染色方法快得多；(5)荧光标记不会影响质谱(Ms)分析结果，因为只有一小部分样品分子被标记，并且在质谱的检测范围内观测不到被标记蛋白质的肽段。DICE技术的缺点是其标记方法只适用于含有赖氨酸的蛋白质；对于赖氨酸含量少的蛋白质，DICE标记有一定的困难。DIGE标记后的蛋白质在胶上向高分子区移动，分子质量大约增加015122_u，pI值不改变。因为只有-b部分蛋白质被标记，大部分蛋白质在Cy3、Cy5标记的谱图上看不到，所以未被DIGE标记的蛋白质可进一步通过荧光染料SYPRO Ruby染色确认。
13、对于感兴趣的蛋白质也可以通过其经SYPRO Ruby染色得到的谱图与经Cy3、Cy5标记的谱图进行比较而获得确认10-Lq。132生物传黪器技术随着科学技术的发展以及各种新型材料的出现，各种生物传感器在医学上的应用领域将越来越广泛，将生物传感器用于生化反应的监视，可以迅速地获取各种数据，有效地加强生物工程产品的质量管理。生物传感器已在治疗癌症药物的研制方面发挥了重要的作用。如将癌症患者的癌细胞取出培养，然后利用生物传感器准确地测试癌细胞对各种治癌药物的反应，经过这种试验就可以快速地筛选出一种最有效的治癌药物。生物传感器可实时检测生物大分子之间的相互作用。借助于这一技术动态观剪莘抗原、抗体之间结
14、合与解离的平衡关系，可较为准确地测定抗体的亲和力及识别抗原表位。Gebbert等n将免疫球蛋白(IgG)抗体通过硅烷化固定到钽电极上，在流通体系中检测IsG。他们还将这种传感器用于在线监测灌注反应器中培养杂化细胞过程中产生的单克隆抗体，其结果与流动注射荧光免疫测定法和离线酶联免疫吸附测定法相近，由于无需标记试剂，这种方法更简单而且能监测分析物的动态变化，较常规方法省时、省力，结果也更为客观可信，在生物医学研究方面已有较广泛的应用。133蛋白质组学鉴别技术叫煎瞢(m鹬s spectrometryMS)(1)质谱原理。1906年Thomas发明了质谱仪，20世纪80年代末美国科学家JohnBFen
15、n和日本科学家田中耕一分别开发出电喷雾电离和基质辅助激光解析电离两种软电离技术。推动了生物质谱的发展。MS技术的基本原理是通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子，然后利用质谱分析仪的电场和磁场把蛋白质离子分离开，最后确定离子的质荷比值，分析鉴定未知蛋白质，该技术具有高灵敏度、高精确度、高通量和易自动化等优点，不足之处是难于进行N端及C端的氨基酸序列鉴定。目前常用于鉴定蛋白质的技术有：基质辅助激光解析离子化一飞行时间质谱(MALDI_10卜MS)：利用基质吸收激光的能量使固相的多肽样品离子化，获得蛋白质的肤质量指纹图(PMF)，然后通过相应的数据库搜索，鉴定蛋白质；电喷雾质谱(ESIMS)：在喷射
16、过程中以连续离子化方式使多样品电离；串联质谱(MS舢S)：用于肤段的氨基酸测序；表面增强激光解析离子化一飞行时间质谱(sELDI川0F-MS)：直接在固相吸附蛋白质的芯片表面使用脉冲氮激光能量，使被捕获的靶蛋自从芯片表面电离出来，根据靶蛋白在离子装置中的飞行时间测量出其分子质量【(2)质谱技术的应用。近年来研究和应用的质谱技术也越来越多，如多维色谱技术、SELDI-TOF MS技术、亲和色谱技术等。其中飞行质谱技术是近几年新兴的差异蛋白质组学技术，这一技术的最大优点是快速、简便、易行、样本用量少和高通量分析。其中最成熟的SELDI-TOF MS技术在乳腺癌的前期诊断方面已有突破性进展。从目前的
17、发展方向看，液相色谱质谱联用成为蛋白质组学分离技术的个新的生长点，而且越来越受到关注，其最突出的优点是对全蛋白质组分进行分析时的歧视效应大大降低，而且可以实现蛋白质分离与鉴定的在线联用，万方数据有利于蛋白质组研究的自动化和高通量化。如：最近新出现的001)。对鳞癌而言，CYFRA21一l的敏感性显著高于SCC一种快速的、大规模的、较全面的蛋白质分离方法多维蛋白质鉴定(471，P005)；对腺癌而言，CYFRA211的敏感性及准确性技术(multidimensional protein identification technology，MudPrr)，高达754及781。该研究结果表明，C碾A
18、2ll有可能代利用液相色谱、串联质谱的联用技术，结合sEQUEsT数据库检替SCC成为检测肺鳞癌的首选肿瘤标志物，与同年Ebert等ILSl索方法，共检出和识别了2 363个水稻蛋白质，这是到目前为止报道国际多癌症中心研究的结果基本相似。Kim等，q使用2一DE蛋白质组相关文献报道中鉴定蛋白质数目最多的一次，充分体结合基质辅助激光解析电离一飞行时间质谱研究肝肿瘤组织和现了多维色谱在蛋白质组分离中的巨大潜力。非肿瘤组织发现，蛋白异构酶A3的二硫化物明显增多，热休克134生物信息学随着功能基因组研究的深入，2一DE、MS和蛋白、组织蛋白酶D等显著减少，认为这些可能成为肝癌诊断、蛋白质芯片分析等都将
19、产生高通量的生物信息，因此需要多种预后及治疗的相关标志物。Mary等l玎|应用2-DE结合飞行时间庞大的数据库作为支持，数据库和分析软件成了蛋白质组学研质谱、液相色谱质谱分别分析比较了HBV相关肝癌患者和慢究不可缺少的信息学手段。针对不同的研究目的，蛋白质数据性肝炎及正常对照组去除含量较高的免疫球蛋白及未去除免库的种类各不相同，包括2一DE蛋白质的图谱数据库、蛋白质氨疫球蛋白前血清的糖蛋白，发现血清中部分蛋白核心高度的岩基酸序列数据库、蛋白质结构域与家族数据库和蛋白质高级结藻糖基化，其中19种岩藻糖基化蛋白含量明显升高，这些蛋白构及分类数据库等，其中2一DE图谱数据库是蛋白质组学研究中包括我们
20、临床中诊断肝癌常用的AFP，免疫印迹法也验证了常用数据库。这个结果，这些岩藻糖基化蛋白在AFP阴性的肝癌患者中也明2蛋白质组学在肿瘤血清标志物研究中的应用显升高，这些高度岩藻糖基化的蛋白可能成为血清标志物。由21生物材料血蘸于血清是一种复杂的体液成分，其蛋白组成除了白蛋白和免疫血液中常含有癌细胞泄漏、分泌、特殊修饰的蛋白质或降球蛋白等主要高丰度蛋白外，绝大多数是机体组织、细胞分泌解片段。血液作为研究材料且有实验取材和临床应用方便，便和脱落到血中的低丰度蛋白质，其中一些为信号传导和调控的于使用ELISA等手段检测而且有应用便捷、廉价等优点。但血关键蛋白fl目。因此，通过实验在血清中快速、灵敏、准
21、确地找到肿液同时也具有成分复杂、蛋白质丰度波动范围大、高丰度蛋白瘤前期标志物极具有挑战性和实用性。对低丰度信号的遮掩等缺点。而在标志物发现研究阶段，一个总之，开展疾病的血清蛋白质组学研究，寻找、鉴定低丰度需要克服的最大困难是用于这个流程末端的一些分析工具如的功能性蛋白质，将有利于阐明疾病机理，为疾病诊断提供新质谱在一定总量的蛋白质中具有确定的数量鉴定限度。为了充方法。此外利用蛋白质组学方法可以在血清蛋白中寻找多种与分消除质谱肽段鉴定在灵敏度方面的局限性，非常有必要富集全身疾病相关的蛋白质标志物如肿瘤标志物，以达到早期诊断去除高丰度蛋白之后的混合物用于潜在的生物标志物研究。为目的。随着技术手段的
22、不断进步，蛋白质组学在肿瘤标志物研了达到这个目的。就需尽可能地去除干净在复杂外周体液如血清中存在的高丰度蛋白。但是，高丰度蛋白的高浓度(遮盖潜在标志物)和动态波动两个关键因素会影响任何一种纯化目的蛋白质的策略。此外，潜在生物标志物与已知蛋白的比例需要进一步提高以有助于未知候选标志物的鉴定，因此常在质谱分析前先用离子交换色谱或疏水交换柱等手段进行样品中目的蛋白的富集和浓缩。22肿瘤标志物的发况和意义利用目前蛋白质组学技术，在肿瘤患者血清中筛选标记物，主要的临床价值在于有助于肿瘤的早期诊断、疗效评估，为治疗和预后判断提供指导。肿瘤标志物是肿瘤在发生、增殖、侵袭或转移过程中，由癌细胞生物合成、分泌、
23、泄漏或者是宿主对肿瘤反应性的一类分子嗍。多年来随着科技的发展，已在肿瘤患者的血清中找到了一些肿瘤相关的标志物。1994年Koga等141采用放射免疫分析技术检测137例肺癌患者的血清，CYFR21 1的浓度阈值为22 ngml，其敏感性、特异性及准确性分别为577、919及649。血清CYFR211浓度及敏感性随病情进展而升高。从组织学角度来看，CY兀lA211对鳞癌的敏感性(765)较腺癌(478)和ScLc(421)显著高(Po01，P005)，对鳞癌I一期患者的敏感性分别为60O、888、80O及100。与癌胚抗原(CEA，453)、鳞状细胞抗原(squamous cell carcin
24、oma antigen SCC，226)相比。CYFRA21一l对肺癌(不分组织学类型)的敏感性最高(577，P005，P究方面已取得了重大突破，加速了标志物的研究步伐。但它仍有不尽完善之处，因此，在选择每类肿瘤标志物检测方法进行肿瘤筛查时，应注意根据其特异性和对易感人群的敏感性及早期肿瘤的检出率与肿瘤患者5年生存率进行合理选择。切不可盲目筛查，以免造成卫生资源不必要的浪费。另外在技术方面还存在一些不足，例如2-DE还存在蛋白质的丢失、分离容量有限、重复性差、低丰度蛋白质点的难以检测、极酸性及极碱性和高分子质量区蛋白质的难以分离、疏水性膜蛋白的难以分离提取且操作费时和高丰度蛋白难以去除等嗍，这
25、将影响肿瘤标志物研究的精确性与检出率，但相信随着研究的深入及样本电泳技术、切割技术、芯片技术、质谱技术和生物信息学等的不断完善与发展，蛋白质组学技术可以更加快速、灵敏、特异、自动化地进行肿瘤蛋白质的分析，不久以后肿瘤标志物的研究必将取得实质性的进展。参考文献：【1Carr SA，Ceils JEBiomarkem and clinical proteomics叨Moleell Pro-teomics，2006。5(10)：17192Etzioni R，Urban N，m皿8ey S，et aL The cafor early deteetion叨Nature Rev Cancer，2003，3
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27、Ag或HBeAg阳性血清混匀。使混合后的浓度分别为6 gL、12 sL、24 sL、489L和96 sL；孵育8h、16 ho采用ELISA法测定HBsAg或HBeAg的滴度，观察其对HBsAg或HBeAg的抑制作用。结果96 gL和48 gL浓度的田基黄在作用16 h后对HBsAg或HBeAg具有明显的抑制作用(f，O01)。结论田基黄在体外有较强的抗HBsAg和HBeAg作用。关键词：田基黄；HBsAg；HBeAg；抑制中图分类号：R961文献标识码：B田基黄，民间别名有小元宝草、雀舌草、七层塔等，为藤黄科植物田基黄(Hypeficum japonicum nunB)的全草，广泛分布于我国
28、南方，尤其广西桂东南一带，华北地区也有产出【q。民间用其全草治疗肝炎，疗效确切。其性味苦、甘、平，能清热解毒、渗湿利水、消肿止痛。本研究采用EUSA技术，观察田基黄在体外对乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)和乙型肝炎病毒核心抗原(HBeAg)的抑制作用。1材料HBsAg、HBeAg阳性血清各6份，由广西玉林市红十字会医院检验科提供。11主要菊物与试剂HBsAg、HBeAg阳性血清田基黄由广西玉林制药有限责任公司提供。HBsAg检测试剂盒(酶联免疫吸附试验，EUSA)，批号：200706003；HBeAg检测试剂盒(ELISA)，批号：200708008，均为北京科卫临床诊断试剂生物技术有限公司
29、产品。文章编号：16711246(2009)04-0124_0212主要仪器与粳各RT-2100C型酶标仪(深圳雷杜生命科学服务公司生产)；RE-52A型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂生产)；FWl00型高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司生产)。2方法21田基黄醇提取馥的|l备田基黄的化学成分主要有2大类。分别为黄酮、黄烷醇及其苷类和间苯三酚衍生物12q，一般都难溶于水，故选用醇提法提取抗病毒样品液。将15 g田基黄粉末(用FWl00型高速万能粉碎机将田基黄粉碎)放于索氏提取器中，加150 ml 75的乙醇在90水浴中回流提取3 h，取出提取液，再次加150 ml 75的乙醇在90水浴中
30、回流提取3 h，合并提取液，用RE-52A型旋转蒸发仪将提取液浓缩至5 ml，使样品液浓度为3舒ml。22ELISA法定量检测I-BsAg和HBeAg嗍用磷酸缓冲液(PBS)按1：2将血清作倍比稀释，ELISA法，-I，21P，21P2It，coplasmagenitailiumJ】Eleetrophoresis，1995，16(7)：1090【6】OFarrellPH Hi【咖resolution two-dimensional dectrophoresis of prD-teinsJJ Biol Chem，1975，250：4007【7Guo Yaojun Protocols in Pro
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